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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 化学化工区 » 分析 » 其他分析 » 测定鱼肉中组织蛋白酶B、B+L的酶活，为何后者会比前者小？
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jingmaoluhan

新虫 (初入文坛)

[求助] 测定鱼肉中组织蛋白酶B、B+L的酶活，为何后者会比前者小？

如题，我的测定方法如下：1g肉糜加入到冰冷的10ml粗酶提取液中,低温下均质一分钟，将混合物离心1000g-45min-4℃，过滤得到上清液。测定蛋白含量。0.5ml粗酶液（50mm乙酸钠缓冲液，PH=5.0， 1mmEDTA， 0.2%v/v Triton X-100）与1.25ml反应缓冲液（B, B+L：200mm磷酸钠缓冲液，2mmEDTA，0.05%（w/v）CHAPS， 4mmDTT, pH=6.0；H：200mm磷酸钠缓冲液，2mmEDTA，0.05%（w/v）CHAPS， 4mmDTT, pH=6.6）反应2min，40℃，之后加入0.5ml 20um底物溶液（B底物: Z-Arg-Arg-7-amido-4-methylcoumarin hydrochloride；B+L底物: Z-Phe-Arg-7-amido-4-methylcoumarin hydrochloride；H底物: L-arginine-7-amido-4-methylcoumarin hydrochloride
），反应时间为10min， 之后加入2ml终止液（100mm氯乙酸钠，70mm乙酸，30mm乙酸钠，PH=4.3）终止反应。采用荧光分光光度计测定，发射波长为510（460）nm，激发波长为350nm。酶活单位U ，One unit (U) of enzyme activity was defined as the amount of enzyme that hydrolyses the substrate and releases 1 um AMC per min at 30 ℃. Cathepsins activities were expressed as U/mg of protein.
标准曲线用不同浓度的7-amino-4-methylcoumarin (AMC 7-氨基-4甲基香豆素)溶于终止液中制作。将AMC溶于1ml粗酶提取液+2.5ml反应缓冲液+0.5ml水+4ml终止液 中，制成不同浓度的溶液
但是结果不是很稳定，有时候组织蛋白酶B酶活大于B+L的酶活，有时会小于（小于是正常的），这是为什么？请问有人遇到过类似方面的问题吗？跪谢！！！
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1楼 2014-07-17 23:24:12
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心若止水i

新虫 (小有名气)
请问您找到原因了吗？我用您的方法可以不~
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6楼2022-05-08 10:34:02
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jingmaoluhan

新虫 (初入文坛)
大神快快现身吧！
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2楼2014-07-18 09:44:21
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or鸢尾

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by jingmaoluhan at 2014-07-18 09:44:21
大神快快现身吧！

楼主，您好，对于您的问题不好意思我也不会，单能否请教您个问题，我是用荧光光度计测定酶，已绘制标准曲线（浓度-荧光强度），如何转换成酶活？感谢啊！！！！！等您回复
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4楼2015-06-10 16:29:15
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心若止水i

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by or鸢尾 at 2015-06-10 16:29:15
楼主，您好，对于您的问题不好意思我也不会，单能否请教您个问题，我是用荧光光度计测定酶，已绘制标准曲线（浓度-荧光强度），如何转换成酶活？感谢啊！！！！！等您回复...

您好，请问您最后是怎么做的呢？另外想问一下，我把处理好的鱼肉放到-80冰箱里，取出来之后进行处理提取粗酶液，怎么解冻呢。谢谢啦
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5楼2022-05-08 10:31:24
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