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studentg

金虫 (小有名气)

[求助] 如何确定外源基因产生的蛋白在细菌E.coli体内是否内存在活性(in vivo)? 已有7人参与

我现在研究某代谢相关的基因,想请教各位一个问题。 除了利用E.coli表达后纯化得到蛋白再进行活性测定和产物分析外,有没有其他的方法可以确定表达出的蛋白在E.coli细胞中就存在活性?不知道问题是否说清楚了,还望各位不吝赐教。
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道法自然,探其精妙。
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studentg

金虫 (小有名气)

引用回帖:
7楼: Originally posted by 867575969 at 2014-07-11 11:17:25
给lz提供一个思路,既然该蛋白与某代谢相关,添加外源物质或者改变外界因素,看代谢途径是否有所变化(与先前途径比较),不知道这个方法怎样,毕竟也没做过,希望可以帮助lz!

也是这么想的,想问问大家有没有研究的经验。
道法自然,探其精妙。
15楼2014-07-12 04:48:07
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金虫 (小有名气)

引用回帖:
10楼: Originally posted by kuailechongb at 2014-07-11 12:54:48
直接向微生物培养基中添加底物看有没有转化也行啊,不过也得做一个空白对照,这样不一定要纯化蛋白后才能进行酶活检测。

谢谢,也可以这么试一试。
道法自然,探其精妙。
16楼2014-07-12 04:49:24
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studentg

金虫 (小有名气)

引用回帖:
18楼: Originally posted by 动力泉 at 2014-07-12 01:09:55
这个方法是行不通的,除非加上一些特定原核信号肽。由于原核表达一般除去了信号肽,表达的蛋白无法进行跨膜分泌,这也是后续蛋白纯化前要超声破碎的原因
...

您说的有道理,但在下面的这个情况下这个方法是否可行呢?比如我从物种A中得到某蛋白(pro A),而且E coli 中也有同类蛋白(pro E),我现在把该蛋白对应基因转到E coli中,检测pro A在其中是否有活性。能否这样做呢?
道法自然,探其精妙。
26楼2014-07-13 02:06:19
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