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戊二醛法合成抗原中的还原问题 已有1人参与
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各位虫友，本人在做戊二醛合成抗原的实验，遇到一些问题，已经僵持了两个多月了，所以特来论坛请教各位。问题如下： 本人用戊二醛作交联剂，因为市售的戊二醛浓度表示“50% in water”，没有写是什么浓度，查看了下帖子，都说按质量分数算，大概算了下，文献里提到的20mM的浓度差不多是稀释250倍，所以我稀释之后使用的浓度是0.2%，添加量是1ml。我用的蛋白是20mg 的BSA，半抗原是含氨基的螯合剂（氨基的摩尔数是1.5*10-5mol）。操作是先将金属和螯合剂反应一段时间，然后加戊二醛过夜，第二天加到蛋白溶液里搅拌24h 。最后加硼氢化钠还原。 1：把半抗原反应液加到蛋白溶液里的时候，体系出现浑浊。首先说明，滴加的速度已经比较慢了，差不多200ul都要滴加一两分钟了。是因为戊二醛的量多了吗？还是什么原因？第一次做的时候因为沉淀太多，蛋白条带也跑不出来。 2：戊二醛反应是不是每次的结果都不一样呢？做了好几次，结果紫外结果显示都有一定的差异。 3：戊二醛反应最后生成希夫碱之后，是不是需要加还原剂还原？我用的是硼氢化钠，但是因为螯合剂上有羧基，不知道会不会被还原？而且，想问下各位虫友，硼氢化钠和希夫碱反应的比例应该是多少呢？我看到有文献提到10mg/ml，所以我用了40mg，但是气泡产生的非常多，而且原本体系中的浑浊也变澄清了，颜色也从黄色变成了别的颜色。是因为ph改变了的关系让沉淀重新溶解了吗？ 因为本人化学方面确实不精通，所以不甚了解。希望各位虫友多发意见，谢谢大家！！ |
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3楼2014-07-08 10:56:37
凌波丽
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【答案】应助回帖
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戊二醛必定会引起蛋白质分子之间发生交联，你一般不要使用戊二醛把半抗原连接到BSA等连接蛋白质上，形成完全抗原，这样一般地会有各种连接蛋白分子之间的交联，而形成空间位阻，遮蔽和完全占据抗原免疫簇。半抗原连接到BSA等连接蛋白质上，形成完全抗原时，抗原免疫簇由半抗原小分子和连接蛋白质共同构成，不是有半抗原小分子完全地决定完全抗原的免疫反应性，换言之，同样的半抗原小分子连接与不同的连接蛋白质，免疫实验动物后，在体外培养融合筛选得到的单克隆抗体也可能是不同的。半抗原是含氨基，连接蛋白质必有游离羧基，你用碳二亚胺很容易在室温下就完成共建链接形成完全抗原，碳二亚胺是零臂连接催化剂，不可能形成蛋白质之间的分子交联物，因为空间位阻的关系。 楼主需要了解更多Bioconjugation，可以参考：“确定蛋白质—多肽相互作用结合位点的实验设计：凌波丽个人总结之二 ”，下载：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=6739957&fpage=1&target=blank文中有Bioconjugation的常见方法举例说明。 |
2楼2014-07-08 10:17:58
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4楼2014-07-08 16:49:10
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| 补充一下：用EDC的话，只要半抗原与BSA摩尔数比在10:1到50:1就差不多了，半抗原的量可以更大，另外，反应溶液就用水，用不着调成酸性，EDC催化活性很强，一般可以在0-4度的恒温箱内反应，时间过一夜即可。然后用质谱检测链接效果。作为课题稍微扩展：可以在确定半抗原——BSA形成的完全抗原与抗体的具体结合位点的解析。楼主可以参考：“确定蛋白质—多肽相互作用结合位点的实验设计：凌波丽个人总结之二 ”，下载：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=6739957&fpage=1&target=blank，具体的实验流程，此文已经完整给出。 |
5楼2014-07-09 00:31:28
