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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 枯草芽孢杆菌表达人源蛋白的问题
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xissy

铜虫 (小有名气)

[求助] 枯草芽孢杆菌表达人源蛋白的问题

小妹最近在做枯草芽孢杆菌表达人来源的重组蛋白，发现很多蛋白都不表达，或者表达的非常不好。WESTERN可以检测，SDS-PAGE看不到。而芽孢自身来源的重组蛋白表达却不错。但是我的最终目的就是用来表达人源蛋白的。请问做重组蛋白表达的话，枯草芽孢杆菌适合表达什么蛋白呢？
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1楼 2014-06-24 15:22:24
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tingyuxuanzr

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by xissy at 2014-06-26 21:32:48
我是选择的WB800。我现在用的是pHT43自身携带的信号肽，淀粉酶的信号肽。
芽孢属的蛋白做了2个，基本上有1mg/300ml，这个是条件还没有优化的。可以满足我的需要。
我想问的是，需要同一个质粒构建几个不同的信号 ...

可是在文献中都说WB800有氯霉素抗性，而pHT43也是氯霉素抗性，我做的WB800可以用氯霉素抗住，但是有卡那霉素的抗性，不知道这是为什么。
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11楼2015-12-04 14:45:38
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huangrui1988

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
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xissy(kx444555代发): 金币+3, 鼓励交流 2014-06-25 08:33:43
xissy: 金币+3 2014-06-26 21:29:39
gyesang: 应助指数+1 2014-06-29 17:45:57
是这样的，首先选择菌株很重要，WB800敲除了多个蛋白酶，可能对你更加合适。其次，你要选择合适的信号肽来分泌你的蛋白，wb可以检测，说明已经分泌了，你可以看看有没有活性。SDS page的灵敏度肯定没有WB高啊，这个·很正常，一般都要浓缩的，工业上也要高密度发酵的啊，接着分泌水平基本上有10-50倍的提高，所以不用担心。自身来源的蛋白不错，有多不错？g/l?你自己做的数据是？枯草芽孢杆菌表达大宗酶类，如淀粉酶效果不错，可以有25-30g/l
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2楼2014-06-24 15:56:09
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penfour

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
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gyesang: 金币+2, 应助指数+1, 鼓励交流！ 2014-06-29 17:46:08
枯草芽孢杆菌表达外源蛋白的话，其分泌能力很差，不像表达同其内源相近的蛋白那样分泌出来，不知你是如何检测的，也许蛋白表达了，只是在胞内，你没有检测到？
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3楼2014-06-25 16:17:43
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pypsak

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
gyesang: 金币+2, 应助指数+1, 鼓励交流！ 2014-06-29 17:46:18
也可能是本身这个表达系统的限制，毕竟现在做抗体药的都是用CHO系统，
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4楼2014-06-25 16:47:49
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