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铁虫 (小有名气)

[求助] 菌种构建过程酶切位点发生改变

大家好,本人购买了一双基因载体pET-Duet-1,插入两个基因构建了一工程菌,但是测序后发现有一个基因出现了碱基缺失,所以重新进行构建,但是第二次构建的时候出现了问题,在酶切准备插入第二个基因的时候发现有个酶切位点就是切不开,一开始以为酶失效了,但是经验证酶没有问题,那这样的话就是这个酶切位点自己突变了么?如果是这样问题可能出现在哪步,要怎么进行解决?
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