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求原核表达IL-2产物的生物活性实验方法
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本人现正在进行IL-2原核表达产物的生物活性鉴定,现求详细实验方案.请各位高手指点!邮箱:long0553@163.com [ Last edited by long0553299 on 2008-3-24 at 13:34 ] |
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2楼2008-03-24 14:41:25
elvias
铁杆木虫 (正式写手)
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你可以用淋巴细胞增殖试验 操作步骤 无菌从肝素抗凝血中分离外周血单个核细胞(PBMC) 洗涤后用10％FCS RPMI1640调整细胞数为1～2×10６／ml ↓ 加入96孔培养板中，1～2×10５细胞／100μl／孔，每组设3孔。 加入最适剂量PHA，100μl／孔，同时设不加PHA阴性对照。如观察细 胞因子(如IL-2)或其它刺激物(PMA)对增殖功能的调节作用，则根据 加入因子的浓度而确定加入量，一般每孔最终体积为200μl ↓ 37℃、5％ CO２孵育，66h 每孔加入0.5～1μci ３H-TdR(50μl) ↓ 继续培养6～12h 用DYQ-Ⅱ型多头细胞收集仪收集样品 于"9999"型玻璃纤维滤纸上 ↓ 烤干后β液闪仪计数 计算 1. 增殖水平直接用CPM值表示。 2. 也可用刺激指数(SI)表示: PHA(或实验组)cpm-机器本底 SI＝─────────────── 阴性对照组cpm-机器本底 |
3楼2008-03-24 16:08:36
4楼2008-03-24 16:24:41
5楼2008-03-24 19:05:14
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我找到一个http://www.uscnlife.cn/web/page/news1011.htm上的，不知道对你有用不： IL-2的生物学测定方法 生物活性检测法是检测反应细胞对IL-2的增殖反应，以下三类细胞可作为IL-2检测细胞：①IL-2依赖细胞株，目前使用的主要有：CTLL、CTB6、F12、CTLL-2；②丝裂原活化的T淋巴母细胞；③小鼠胸腺细胞。IL-2反应细胞增殖可以通过活性染料染色，显微镜直接计数，3H-TdR或“I-UdR的DNA掺入量或以活性细胞代谢率为指标来表示。 1．3H-TdR掺人法 (1)在96孔板中每孔加100／~L不同稀释度的IL-2待测样品，设培养液对照和不同浓度IL-2标准品对照，均做3复孔。 (2)向各孔内加100bL检测细胞(CTLL-2 1X104／孔)。置37~(2，5％C02温箱中培养24h。 (3)每孔加入0．5uCi 3H-TdR，继续培养4—6ho (4)收集细胞，检测细胞的3H-TdR掺人值，以3复孔的cpm均值表示。 (5)按概率单位分析法计算IL-2单位 (6)注意事项：①CTLL-2细胞对鼠IL-4亦有增殖反应，若标本中含slL-4，将影响检测结果。此时可用抗IL-4McAb处理标本后测定。但CTLL-2细胞对人IL-4无反应；②CTLL—2细胞存活率应大于95％。洗涤细胞时操作不应太剧烈，因为CTLL-2细胞膜极脆，容易破碎。 2．12SI_UdR微量测定法 用“I-UdR代替3H-TdR的优点是不需液体闪烁测定所需试剂及设备，只需一台小型卜计数器即可。并可节省时间和减少液体闪烁测定操作中的误差。缺点是“I-UdR牛衰期较短，需定期供应。基本方法同’H-TdR掺人法。细胞培养后，每孔加0．2pCi“I-UdR，然后再加10—3mol／L 5-氟尿嘧啶5ul，继续培养24h，收集细胞，用Y-计数器检测。 3．MIT比色分析法 原理见IL-1的检测。 (1)同3H-TdR掺人法加样品和细胞。 (2)细胞培养至22—24h，每孔加入10txLMTr(5mF／mL)，继续培养4ho (3)从每孔吸出100pL上清弃去，加酸化异丙醇100／xL／孔，充分混匀，以溶解甲、僭颗粒。 (4)用酶标以检测波长为570nm，参考波长为630nm分别测量OD值。OD570nm—OD630nm，再减去培养液对照的OD值。 (5)用log2稀释度(X)和各稀释度对应的OD值(Y)作直线回归。按上述概率单位分析法计算待测样品的IL-2活性单位。 4．ConA诱导T细胞微量测定法 有丝分裂原可以使淋巴细胞转化为淋巴母细胞。淋巴母细胞表达丰富的IL-2受体，该细胞在体外IL-2存在时能持续扩大培养并与IL-2含量呈剂量依赖关系。它对有丝分裂原无反应性或反应极微。因此在无IL-2依赖细胞株的情况下，可以用此细胞作IL-2检测。 (1)ConA诱导IL-2反应细胞制备：取C57BL／6小鼠脾脏磨碎后，配成5X106／mL单个细胞悬液。加入ConA 5／／s／mL，置5％C02，37~C温箱中培养40—48h。将培养的细胞悬液置于淋巴细胞分层液上，1 700r／min离心15rain，取界面层细胞即为IL-2反应细胞(淋巴母细胞)。此细胞均为大的淋巴母细胞，并呈多角形，小的休止期细胞少于5％。 (2)检测方法：将反应细胞配成1X106／mL$度的悬液。取0．1mL加入96孔微量培养板各孔，再加入0．1mL待测样品或已知IL-2；置5％C02，37~C温箱中培养40～48h，每孔加入0．5t~Ci／20／zL’H-TdR，继续培养4—6h，收集细胞测定’H-TdR掺人量。 (3)注意事项：①此法不必培养CTLL-2细胞。但由于动物的个体差异，往往使试验结果批间差异较大；②淋巴母细胞的诱导和分离技术不易掌握，有时容易混入较多的休止期小淋巴细胞，这些细胞仍保留对ConA的反应性。因此，作为检测细胞所含休止期小细胞不宜超过5％，并应设ConA反应对照组；③细胞培养收获的时间一般应以无IL-2的对照细胞绝大多数死亡，而加IL-2的实验组细胞生长旺盛时为佳。 小木虫上也有你看看http://www.bioon.com/experiment/General1/310977.shtml [ Last edited by showzoo on 2008-3-24 at 20:54 ] |
6楼2008-03-24 19:31:12
7楼2008-03-24 19:40:59
