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随游

木虫 (正式写手)

[交流] 细胞冻存有遇到过这些问题吗?

很多珍贵的细胞株,冻存后很难复苏,或者复苏后出现大量死亡,不知大家都是怎么处理的,是否解决了这些问题?
我先说说我最近遇到的问题吧。
培养物:杂交瘤细胞
冻存液:90%FBS+10%DMSO
冻存过程:(泡沫盒) -70℃过夜→转液氮保存
复苏过程:40℃水浴→90s内,溶解→1500 rpm,3 min→弃上清,培养基重悬→T75培养瓶培养,5% CO2,37℃,DMEM+20%FBS+双抗
问题:部分细胞复苏之后,大量死亡,有的甚至全部死亡;此类细胞中,部分细胞复苏起来后死的就很多,部分细胞过几个小时后死亡
作出的努力:1、在添加饲养细胞的24孔板内复苏,能抢救一部分,但耗时
                    2、冻存数目增加,占的位置太多,且仍然不能解决
            3、试过不同的冻存液配方,FBS20%、50%、90%都没有明显的改善
最近一次发现,-70保存后复苏比液氮保存后复苏的效果要好很多,这说明我在转液氮的时候出问题了么?可是不是很明白会出啥问题呢~~
请大家都来说一说哈!
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hbl215

金虫 (文坛精英)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
引用回帖:
41楼: Originally posted by hbl215 at 2014-05-28 16:54:11
一般最好是用冻存罐进行冻存,没有的话,先4度10min(省去也差别不大),-20度2小时,然后再转移至-70,全程都是放在泡沫盒里。
复苏用38度,我觉得40度太高了,1分钟内融到剩黄豆粒大小,拿出。杂交瘤细胞比较大的 ...

你冻存管中细胞体积很多么,一般是0.8至1.0ml,1分钟内是没问题的。融到黄豆粒大小后再移管到超净台,这期间拿手握管,手有温度的,期间一直晃管。过火前就可以融掉。我说的黄豆粒是比绿豆大一点的大小啊,不是泡发那么大的啦。可以预先在离心管中加2ml培养基,细胞加进去后,再沿壁逐渐加到6/7m,这样可以让细胞逐渐适应更换的环境。你可以试一下。
至于是不是冻存的因素,若细胞富裕,可以做个对照试一下啊,直接-70冻存,短时间估计影响不大,放久一点就看出来了,我以前干过这事哈,短时间再复苏,看形貌看不出来,但对细胞的伤害肯定有的。

[ 发自小木虫客户端 ]
49楼2014-05-29 08:06:25
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chentao

至尊木虫 (文学泰斗)


随游(金币+1): 谢谢参与
祝福帮顶!
2楼2014-05-28 15:52:04
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随游(金币+1): 谢谢参与


[ 发自小木虫客户端 ]
3楼2014-05-28 15:53:00
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随游(金币+1): 谢谢参与
6楼2014-05-28 16:02:39
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