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随游

木虫 (正式写手)

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[交流] 细胞冻存有遇到过这些问题吗？

很多珍贵的细胞株，冻存后很难复苏，或者复苏后出现大量死亡，不知大家都是怎么处理的，是否解决了这些问题？
我先说说我最近遇到的问题吧。
培养物：杂交瘤细胞
冻存液：90%FBS+10%DMSO
冻存过程：(泡沫盒) -70℃过夜→转液氮保存
复苏过程：40℃水浴→90s内，溶解→1500 rpm，3 min→弃上清，培养基重悬→T75培养瓶培养，5% CO2,37℃，DMEM+20%FBS+双抗
问题：部分细胞复苏之后，大量死亡，有的甚至全部死亡；此类细胞中，部分细胞复苏起来后死的就很多，部分细胞过几个小时后死亡
作出的努力：1、在添加饲养细胞的24孔板内复苏，能抢救一部分，但耗时
2、冻存数目增加，占的位置太多，且仍然不能解决
3、试过不同的冻存液配方，FBS20%、50%、90%都没有明显的改善
最近一次发现，-70保存后复苏比液氮保存后复苏的效果要好很多，这说明我在转液氮的时候出问题了么？可是不是很明白会出啥问题呢~~
请大家都来说一说哈！

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1楼2014-05-28 15:43:16

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hbl215

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引用回帖:

41楼: Originally posted by hbl215 at 2014-05-28 16:54:11
一般最好是用冻存罐进行冻存，没有的话，先4度10min（省去也差别不大），-20度2小时，然后再转移至-70，全程都是放在泡沫盒里。
复苏用38度，我觉得40度太高了，1分钟内融到剩黄豆粒大小，拿出。杂交瘤细胞比较大的 ...

你冻存管中细胞体积很多么，一般是0.8至1.0ml，1分钟内是没问题的。融到黄豆粒大小后再移管到超净台，这期间拿手握管，手有温度的，期间一直晃管。过火前就可以融掉。我说的黄豆粒是比绿豆大一点的大小啊，不是泡发那么大的啦。可以预先在离心管中加2ml培养基，细胞加进去后，再沿壁逐渐加到6/7m，这样可以让细胞逐渐适应更换的环境。你可以试一下。
至于是不是冻存的因素，若细胞富裕，可以做个对照试一下啊，直接-70冻存，短时间估计影响不大，放久一点就看出来了，我以前干过这事哈，短时间再复苏，看形貌看不出来，但对细胞的伤害肯定有的。

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