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随游

木虫 (正式写手)

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[交流] 细胞冻存有遇到过这些问题吗？

很多珍贵的细胞株，冻存后很难复苏，或者复苏后出现大量死亡，不知大家都是怎么处理的，是否解决了这些问题？
我先说说我最近遇到的问题吧。
培养物：杂交瘤细胞
冻存液：90%FBS+10%DMSO
冻存过程：(泡沫盒) -70℃过夜→转液氮保存
复苏过程：40℃水浴→90s内，溶解→1500 rpm，3 min→弃上清，培养基重悬→T75培养瓶培养，5% CO2,37℃，DMEM+20%FBS+双抗
问题：部分细胞复苏之后，大量死亡，有的甚至全部死亡；此类细胞中，部分细胞复苏起来后死的就很多，部分细胞过几个小时后死亡
作出的努力：1、在添加饲养细胞的24孔板内复苏，能抢救一部分，但耗时
2、冻存数目增加，占的位置太多，且仍然不能解决
3、试过不同的冻存液配方，FBS20%、50%、90%都没有明显的改善
最近一次发现，-70保存后复苏比液氮保存后复苏的效果要好很多，这说明我在转液氮的时候出问题了么？可是不是很明白会出啥问题呢~~
请大家都来说一说哈！

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1楼2014-05-28 15:43:16

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随游

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引用回帖:

41楼: Originally posted by hbl215 at 2014-05-28 16:54:11
一般最好是用冻存罐进行冻存，没有的话，先4度10min（省去也差别不大），-20度2小时，然后再转移至-70，全程都是放在泡沫盒里。
复苏用38度，我觉得40度太高了，1分钟内融到剩黄豆粒大小，拿出。杂交瘤细胞比较大的 ...

可是38度，要完全溶解的话需要的时间早就超过1分钟了，DMSO在这个温度对细胞的伤害还是很大的啊。
另外，还有黄豆大小的冰块就不溶解直接去离心了吗，这样对细胞没有伤害吗？话说我都是完全溶解了才去离心的哦。
我比较过几种杂交瘤细胞的离心转速，15000,3min，还好，问题不大，至少我的实验结果显示差不多的。
我做过2种杂交瘤细胞和一种骨髓瘤细胞，-70直接复苏的效果都还不错，只是，在-70里面放置的时间再一周以内，长时间的我没有试过。其实我做这个，就是为了找冻存细胞出问题的原因，长期保存，在液氮是最好的，-70只是短时间比较好。