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随游

木虫 (正式写手)

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[交流] 细胞冻存有遇到过这些问题吗？

很多珍贵的细胞株，冻存后很难复苏，或者复苏后出现大量死亡，不知大家都是怎么处理的，是否解决了这些问题？
我先说说我最近遇到的问题吧。
培养物：杂交瘤细胞
冻存液：90%FBS+10%DMSO
冻存过程：(泡沫盒) -70℃过夜→转液氮保存
复苏过程：40℃水浴→90s内，溶解→1500 rpm，3 min→弃上清，培养基重悬→T75培养瓶培养，5% CO2,37℃，DMEM+20%FBS+双抗
问题：部分细胞复苏之后，大量死亡，有的甚至全部死亡；此类细胞中，部分细胞复苏起来后死的就很多，部分细胞过几个小时后死亡
作出的努力：1、在添加饲养细胞的24孔板内复苏，能抢救一部分，但耗时
2、冻存数目增加，占的位置太多，且仍然不能解决
3、试过不同的冻存液配方，FBS20%、50%、90%都没有明显的改善
最近一次发现，-70保存后复苏比液氮保存后复苏的效果要好很多，这说明我在转液氮的时候出问题了么？可是不是很明白会出啥问题呢~~
请大家都来说一说哈！

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1楼 2014-05-28 15:43:16

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ankang0910

金虫 (正式写手)

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★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
随游: 金币+2, 哦，谢谢。我一般是复苏到小一号的培养器皿里面，就是觉着放到孔里很耗时啊 2014-05-28 19:06:34

冻存：冻存液要使用90%FBS+10%DMSO的配方，最好使用冻存盒，冻细胞之前每管细胞量多一些。
复苏：你的操作应该没问题，但是建议先复苏到小细胞瓶中，或24孔板的2-3个孔中，T75太大了，瘤细胞相互挨着才能长得好。如果死的太多还是长不起来的话，建议用96孔板培养，这样每孔细胞数相对较多，营养集中，更容易存活。
希望对你有帮助，祝实验顺利！