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Renjingyu

金虫 (小有名气)

[求助] 测序已有2人参与

cdna作pcr然后测序''，竟然测到了一部分内含子序列，是怎么回事？

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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即将加入研究生的大军，迷茫！
1楼2014-05-20 12:53:24
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zhangyunjing

金虫 (小有名气)
★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2014-05-20 13:30:32
cDNA含有基因组DNA污染，引物设计的时候没有在外显子节点处设计，就能以gDNA为模板，扩增出相应的片段
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rainwater
2楼2014-05-20 13:15:02
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jonew

木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
2楼: Originally posted by zhangyunjing at 2014-05-20 13:15:02
cDNA含有基因组DNA污染，引物设计的时候没有在外显子节点处设计，就能以gDNA为模板，扩增出相应的片段

那样子的话 目标条带会不会大很多呢？
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借口很贱，，，
3楼2014-05-20 14:54:54
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zhangyunjing

金虫 (小有名气)
★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-05-20 18:08:13
引用回帖:
3楼: Originally posted by jonew at 2014-05-20 14:54:54
那样子的话 目标条带会不会大很多呢？...

这就看你的引物是怎么设计的了，如果正反向引物在同一个外显子上，扩增出的条带是一样大的，如果一条引物在一个外显子上，另外一条在另一个外显子上，就要看两个外显子之间的内含子长度了，内含子长度越长，扩增的条带就越大。可以将你的引物在primer blast中进行特异性比对，看看以gDNA为模板和mRNA为模板，分别扩增的条带是多大，另外，设计引物时引物跨外显子可以消除gDNA的扩增。
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rainwater
4楼2014-05-20 15:00:56
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Renjingyu

金虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by zhangyunjing at 2014-05-20 15:00:56
这就看你的引物是怎么设计的了，如果正反向引物在同一个外显子上，扩增出的条带是一样大的，如果一条引物在一个外显子上，另外一条在另一个外显子上，就要看两个外显子之间的内含子长度了，内含子长度越长，扩增的 ...

引物设计到了不同的外显子上，内含子全长126bp，最后只扩增出来29bp
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即将加入研究生的大军，迷茫！
5楼2014-05-21 08:19:30
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zhangyunjing

金虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by Renjingyu at 2014-05-21 08:19:30
引物设计到了不同的外显子上，内含子全长126bp，最后只扩增出来29bp...

不妨将引物的序列发过来，帮你分析一下引物的序列，另外，请将是什么物种说明一下
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rainwater
6楼2014-05-21 09:40:57
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Renjingyu

金虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by zhangyunjing at 2014-05-21 09:40:57
不妨将引物的序列发过来，帮你分析一下引物的序列，另外，请将是什么物种说明一下...

玉米的序列  F:5'  ATGGTGACTGTGAGAGAGGA  3'
R:5'  TCACATCATGATTTCTTGATCTC  3'
说可能发生了可变剪切，你觉得可能吗？
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即将加入研究生的大军，迷茫！
7楼2014-05-22 11:11:56
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zhangyunjing

金虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by Renjingyu at 2014-05-22 11:11:56
玉米的序列  F:5'  ATGGTGACTGTGAGAGAGGA  3'
R:5'  TCACATCATGATTTCTTGATCTC  3'
说可能发生了可变剪切，你觉得可能吗？...

这种现象普遍存在，一个基因往往有多个转录本，造成多个转录本原因在于在于剪切内含子时的位置不同，可能在一个转录本中是内含子序列，在另外一个转录本中是外显子序列，所以先看看你研究的基因是否存在多个转录本的情况，如果有的话就核对测序的结果与哪个转录本相对应
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rainwater
8楼2014-05-22 13:21:54
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Renjingyu

金虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by zhangyunjing at 2014-05-22 13:21:54
这种现象普遍存在，一个基因往往有多个转录本，造成多个转录本原因在于在于剪切内含子时的位置不同，可能在一个转录本中是内含子序列，在另外一个转录本中是外显子序列，所以先看看你研究的基因是否存在多个转录本 ...

不可能是一个新的转录本，因为翻译不通
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9楼2014-05-22 18:19:44
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