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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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xiaohehc371

铁虫 (初入文坛)

[交流] 请教关于毕赤酵母转化的疑问!

我做毕赤酵母表达,我的基因整合如毕赤酵母基因组中,我先用Licl方法,结果一个星期才长出针眼大的菌落,别人用电转化的都长的菌落好大,请教一下各位是什么原因?
我想试用PEG1000做转化,可是中间有一步就是不明白怎么做:
Use up to 50 μg of each DNA sample in no more than 20 μl total volume. Add the DNA directly to a still-frozen tube of competent cells. Carrier DNA (40 μg of denatured and sonicated salmon sperm DNA) should be included with < 1 μg DNA samples for maximum transformation frequencies.
中文翻译如下:
在<20ul 水中加入50ug DNA,将DNA 直接加入仍处于冰冻状态的感受态细胞管
中。载体DNA(40ug 变性及超声处理的鲑鱼精DNA)中加入<1ug DNA 样品,检测最大转化效率。

50ug DNA是我线性化的质粒?会不会加的太多了?
载体DNA是单链DNA?一定要超声处理嘛?我煮沸10分钟可以嘛?
1ug DNA样品又是什么意思?怎么检测最大转化率?一定要检测嘛?
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ganchao1776

至尊木虫 (职业作家)

电击转化毕赤酵母(GS115)

细胞准备(感受态制备)
1、GS115种子培养,平板接种于30mlYPD,28~30度215rpm振荡培养约18h
2、接0.5~1.0ml的1到50mlYPD,过夜生长到OD600约1.3~1.5(7~8h)
3、吸1.5ml至1.5ml的ED管,低速离心一到两分钟,收集细胞,用1.5ml预冷的灭菌水悬浮细胞
4、低速离心一到两分钟,收集细胞,用1.5ml预冷的灭菌水悬浮细胞
5、低速离心一到两分钟,收集细胞,用1.5ml预冷的1M的山梨醇(用前灭菌)悬浮细胞
6、低速离心一到两分钟,收集细胞,用100Ul预冷的1M的山梨醇悬浮细胞
经过以上步骤感受态制备完成
在4度冰箱中可保存10天转化率变化很小

电击转化
1、取上感受态细胞80ul与20ul线性化DNA转入预冷的0.2Cm电击杯中
2、冰浴5min
3、依电转化仪用说明进行电击(超级简单)
4、立即加入1ml预冷的1M山梨醇至杯中,将内溶物转入灭菌ED管中
5、分成两三份涂于MD或RDB平板上
下边的就是筛选了
4楼2008-03-14 12:28:39
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xiaohehc371

铁虫 (初入文坛)

还有一个问题就是在PEG法中:
In the morning, use an aliquot of the overnight culture to inoculate a 100 ml YPD culture to a starting OD600 of 0.1 and grow at 30°C to an OD600 of 0.5 to 0.8.
是不是说,种子液要和新的培养基1:1混合,使得OD600=0.1,再让它长到0.5-0.8?那岂不是种子液要很多?
2楼2008-03-13 20:43:20
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ganchao1776

至尊木虫 (职业作家)


reasonspare(金币+1,VIP+0):thx,如果有详细的介绍就好了
没用过你的方法,我一直用电击法转化,感觉这个方法简便且转化率高
3楼2008-03-13 21:29:05
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xiaohehc371

铁虫 (初入文坛)

虫们啊,我们实验室没有电转化仪啊!所以要用别的方法,谁帮忙解释一下PEG法啊!
5楼2008-03-14 13:50:17
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