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请教关于毕赤酵母转化的疑问！
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我做毕赤酵母表达，我的基因整合如毕赤酵母基因组中，我先用Licl方法，结果一个星期才长出针眼大的菌落，别人用电转化的都长的菌落好大，请教一下各位是什么原因？ 我想试用PEG1000做转化，可是中间有一步就是不明白怎么做： Use up to 50 μg of each DNA sample in no more than 20 μl total volume. Add the DNA directly to a still-frozen tube of competent cells. Carrier DNA (40 μg of denatured and sonicated salmon sperm DNA) should be included with < 1 μg DNA samples for maximum transformation frequencies. 中文翻译如下： 在<20ul 水中加入50ug DNA,将DNA 直接加入仍处于冰冻状态的感受态细胞管 中。载体DNA（40ug 变性及超声处理的鲑鱼精DNA）中加入＜1ug DNA 样品，检测最大转化效率。 50ug DNA是我线性化的质粒？会不会加的太多了？ 载体DNA是单链DNA？一定要超声处理嘛？我煮沸10分钟可以嘛？ 1ug DNA样品又是什么意思？怎么检测最大转化率？一定要检测嘛？ |
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2楼2008-03-13 20:43:20
ganchao1776
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3楼2008-03-13 21:29:05
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电击转化毕赤酵母（GS115） 细胞准备（感受态制备） 1、GS115种子培养，平板接种于30mlYPD，28~30度215rpm振荡培养约18h 2、接0.5~1.0ml的1到50mlYPD，过夜生长到OD600约1.3~1.5(7~8h) 3、吸1.5ml至1.5ml的ED管，低速离心一到两分钟，收集细胞，用1.5ml预冷的灭菌水悬浮细胞 4、低速离心一到两分钟，收集细胞，用1.5ml预冷的灭菌水悬浮细胞 5、低速离心一到两分钟，收集细胞，用1.5ml预冷的1M的山梨醇（用前灭菌）悬浮细胞 6、低速离心一到两分钟，收集细胞，用100Ul预冷的1M的山梨醇悬浮细胞 经过以上步骤感受态制备完成 在4度冰箱中可保存10天转化率变化很小 电击转化 1、取上感受态细胞80ul与20ul线性化DNA转入预冷的0.2Cm电击杯中 2、冰浴5min 3、依电转化仪用说明进行电击（超级简单） 4、立即加入1ml预冷的1M山梨醇至杯中，将内溶物转入灭菌ED管中 5、分成两三份涂于MD或RDB平板上 下边的就是筛选了 |
4楼2008-03-14 12:28:39
5楼2008-03-14 13:50:17
ganchao1776
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