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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 全长引物一直P不出目的条带来，请大神看一下我的引物设计有没有问题？谢啦！
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louisjackson

金虫 (小有名气)
我把测序序列跟我的引物比对了一下，上游引物没有匹配的，下游引物却有一定的匹配率，如图。这说明什么问题呢？
全长引物一直P不出目的条带来，请大神看一下我的引物设计有没有问题？谢啦！
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It'snotaboutskill,butaboutwill.
11楼2014-05-13 18:02:15
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luwei13566

木虫 (正式写手)
★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-05-16 13:15:20
晕，下游引物你需要反向互补一下再比对，你把你的测序序列，你要比对的基因序列和你的引物序列都发一份给我吧，我给你比对下，luwei13566@sina.com，你测序是TA克隆后才测的序列还是PCR后直接测的序列？
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大家相互帮助哈
12楼2014-05-13 22:11:41
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louisjackson

金虫 (小有名气)
引用回帖:
12楼: Originally posted by luwei13566 at 2014-05-13 22:11:41
晕，下游引物你需要反向互补一下再比对，你把你的测序序列，你要比对的基因序列和你的引物序列都发一份给我吧，我给你比对下，luwei13566@sina.com，你测序是TA克隆后才测的序列还是PCR后直接测的序列？...

真心谢谢你了，我是PCR后直接拿产物去测的序。我马上把序列发给你，有劳了！
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It'snotaboutskill,butaboutwill.
13楼2014-05-14 15:43:19
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2013Trista

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
引用回帖:
7楼: Originally posted by louisjackson at 2014-05-12 18:58:23
我想请教一下，您的全长引物是如何设计的？我是用的在线设计软件，用前面一段序列设计一对引物，采用其上游引物；用后面一段序列设计一对引物，采用其下游引物。最后再将这上下游引物作为一对引物送去合成，然后我 ...

你P全长序列是干嘛呢？我一般用Primer premier，还可以，你不妨试试。
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14楼2014-05-14 20:07:06
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BioChen

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
louisjackson(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-05-15 21:30:52
你确定你的cDNA没有问题？
cDNA是有组织特异性的，cDAN的质量也是关键。
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15楼2014-05-14 22:04:50
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louisjackson

金虫 (小有名气)
引用回帖:
14楼: Originally posted by 2013Trista at 2014-05-14 20:07:06
你P全长序列是干嘛呢？我一般用Primer premier，还可以，你不妨试试。...

我P全长是为了下一步构建过表达质粒。
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It'snotaboutskill,butaboutwill.
16楼2014-05-15 14:22:51
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louisjackson

金虫 (小有名气)
引用回帖:
15楼: Originally posted by BioChen at 2014-05-14 22:04:50
你确定你的cDNA没有问题？
cDNA是有组织特异性的，cDAN的质量也是关键。

这个我倒是不能确定，但普通引物跑出来的位置是对的，说明在该cDNA中是有表达的。
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It'snotaboutskill,butaboutwill.
17楼2014-05-15 14:24:10
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BioChen

银虫 (正式写手)
★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-05-16 13:15:31
引用回帖:
17楼: Originally posted by louisjackson at 2014-05-15 14:24:10
这个我倒是不能确定，但普通引物跑出来的位置是对的，说明在该cDNA中是有表达的。...

首先查查这个基因在哪个细胞系里面表达相对较高。即使你选对了细胞系，提取RNA转录的过程中，也极有可能得不到全长的cDNA。如果老是PCR不顺利，可以考虑换个cDNA。
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18楼2014-05-15 21:27:42
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