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louisjackson

金虫 (小有名气)

[求助] 全长引物一直P不出目的条带来,请大神看一下我的引物设计有没有问题?谢啦! 已有5人参与

我的模板是逆转录的cDNA,然后P出全长序列后准备连接载体,但是跑出来的条带不是目的条带,不知是不是我的引物设计有问题。
基因信息:Homo sapiens msh homeobox 2 (MSX2), mRNA
NCBI Reference Sequence: NM_002449.4
CDS             89..892
Sample Text
Primer pair 1
        Sequence (5'->3')                                    Length          Tm                 GC%    Self complementarity      Self 3' complementarity
Forward primer        ATGGCTTCTCCGTCCAAAGG        20        60.04        55.00             3.00                                             1.00
Reverse primer        TTAGGACAGGTGGTACATGCC        21        59.44        52.38             4.00                                             3.00
Products on target templates
Sample Text
>NM_002449.4 Homo sapiens msh homeobox 2 (MSX2), mRNA
product length = 804
Forward primer  1   ATGGCTTCTCCGTCCAAAGG  20
Template        89  ....................  108
Reverse primer  1    TTAGGACAGGTGGTACATGCC  21
Template        892  .....................  872
这是我跑出来的条带的位置,完全不是我想要的目的条带的位置。请各位大神帮我分析一下原因,谢谢啦!

全长引物一直P不出目的条带来,请大神看一下我的引物设计有没有问题?谢啦!
JAR GAPDH AND MSX2 FULL-LENGH 2014-05-08 15hr 24min_副本.jpg
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It'snotaboutskill,butaboutwill.
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louisjackson

金虫 (小有名气)

引用回帖:
14楼: Originally posted by 2013Trista at 2014-05-14 20:07:06
你P全长序列是干嘛呢?我一般用Primer premier,还可以,你不妨试试。...

我P全长是为了下一步构建过表达质粒。
It'snotaboutskill,butaboutwill.
16楼2014-05-15 14:22:51
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
louisjackson(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-05-12 17:55:38
你PCR出来的条带跟Marker比是小了一点,但我感觉这个条带是特异性的,你可以回收出来连接到载体上测序试试
学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
2楼2014-05-12 15:11:01
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luwei13566

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
louisjackson(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-05-12 17:55:51
稍微偏小了50bp多一些,而且从图上看貌似你的亮带上方有些模糊的条带,建议回收PCR产物直接送公司测序,先看看序列再说。
大家相互帮助哈
3楼2014-05-12 15:24:35
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louisjackson

金虫 (小有名气)

这是我测序后比对结果的截图,应该是前面与后面都有丢失,但即使匹配的部分突变点也很多!
全长引物一直P不出目的条带来,请大神看一下我的引物设计有没有问题?谢啦!-1
TM截图未命名.png

It'snotaboutskill,butaboutwill.
4楼2014-05-12 16:27:12
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