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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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fwhnny

金虫 (小有名气)

[交流] 求助:基因克隆

我在年前做的关于一个酶基因的克隆,利用RACE技术将5'端,3'端和核心片断都拿到了,现在开学准备再拉一次全长,根据测序结果设计的两端特异引物,但就是克隆不出来?拿以前克隆核心片断时的引物作对照,核心片断还是拿到了的。很是郁闷。
请高手指点一下!
新手上路,请多关照。
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轻5飞扬

金虫 (正式写手)

是不是有较大的内含子呀,所以有两边的引物却拿不到全基因,不知道,瞎说了
2楼2008-03-11 20:18:13
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annwt

木虫 (正式写手)

★ ★
reasonspare(金币+2,VIP+0):xiexie 欢迎常来,.
你只有拉出全长,才叫真正克隆基因,逻辑全长的确问题颇多,这个问题经常发生,你应该好好分析一下。
1,从序列角度分析,你拼接的序列是否上NCBI比对,也就是确定头和尾是否真的是统一的。
2,模板问题,你应该是mRNA,是否由于基因太长,反转录有不到头的问题,可以用你以前的5端引物扩增看看。
3,你目前应该至少有3对引物,可以交叉扩一次,分析引物问题。
3楼2008-03-11 21:24:13
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fwhnny

金虫 (小有名气)

★ ★
reasonspare(金币+2,VIP+0):xiexie 欢迎常来,.
"从序列角度分析,你拼接的序列是否上NCBI比对,也就是确定头和尾是否真的是统一的",头和尾统一是什么意思啊?我拼接后拿到NCBI上比对,能得到相似度最高的就是其它物种中的该酶的基因,是不是这就叫头和尾统一?
    我的模板是mRNA,基因大概1700bp左右。反转录不到头也是可能的,但我也用了5‘race时的库,也没有扩出来。
   实际我现在扩得有1550bp,延伸时间90秒,会不会短了?
4楼2008-03-11 21:57:32
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annwt

木虫 (正式写手)


reasonspare(金币+1,VIP+0):xiexie 欢迎常来,.
如果有其他物种的酶,理论上应该是头尾统一。
你目前应该至少有3对引物,可以自由配对,扩一次,分析引物,分析模板。确定引物和模板没有问题。
最后,上梯度或者降温试试。
5楼2008-03-11 22:37:35
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lauren180

木虫 (著名写手)

小木虫挖井人

你的引物不会有问题吧。公司合成的准确性。有时会让你赶上的。
细推物理须行乐。
6楼2008-03-12 06:09:40
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fwhnny

金虫 (小有名气)

多谢了,我再试试看,应该不会那么霉吧
7楼2008-03-12 13:00:58
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