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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 求助：基因克隆
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fwhnny

金虫 (小有名气)

[交流] 求助：基因克隆

我在年前做的关于一个酶基因的克隆，利用RACE技术将5'端，3'端和核心片断都拿到了，现在开学准备再拉一次全长，根据测序结果设计的两端特异引物，但就是克隆不出来？拿以前克隆核心片断时的引物作对照，核心片断还是拿到了的。很是郁闷。
请高手指点一下！
新手上路，请多关照。
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1楼 2008-03-11 19:52:58
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轻5飞扬

金虫 (正式写手)
是不是有较大的内含子呀,所以有两边的引物却拿不到全基因,不知道,瞎说了
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2楼2008-03-11 20:18:13
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annwt

木虫 (正式写手)
★ ★
reasonspare(金币+2,VIP+0):xiexie 欢迎常来,.
你只有拉出全长，才叫真正克隆基因，逻辑全长的确问题颇多，这个问题经常发生，你应该好好分析一下。
1，从序列角度分析，你拼接的序列是否上NCBI比对，也就是确定头和尾是否真的是统一的。
2，模板问题，你应该是mRNA，是否由于基因太长，反转录有不到头的问题，可以用你以前的5端引物扩增看看。
3，你目前应该至少有3对引物，可以交叉扩一次，分析引物问题。
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3楼2008-03-11 21:24:13
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fwhnny

金虫 (小有名气)
★ ★
reasonspare(金币+2,VIP+0):xiexie 欢迎常来,.
"从序列角度分析，你拼接的序列是否上NCBI比对，也就是确定头和尾是否真的是统一的",头和尾统一是什么意思啊？我拼接后拿到NCBI上比对，能得到相似度最高的就是其它物种中的该酶的基因，是不是这就叫头和尾统一？
    我的模板是mRNA，基因大概1700bp左右。反转录不到头也是可能的，但我也用了5‘race时的库，也没有扩出来。
   实际我现在扩得有1550bp,延伸时间90秒，会不会短了？
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4楼2008-03-11 21:57:32
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annwt

木虫 (正式写手)
★
reasonspare(金币+1,VIP+0):xiexie 欢迎常来,.
如果有其他物种的酶，理论上应该是头尾统一。
你目前应该至少有3对引物，可以自由配对，扩一次，分析引物，分析模板。确定引物和模板没有问题。
最后，上梯度或者降温试试。
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5楼2008-03-11 22:37:35
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lauren180

木虫 (著名写手)

小木虫挖井人
你的引物不会有问题吧。公司合成的准确性。有时会让你赶上的。
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细推物理须行乐。
6楼2008-03-12 06:09:40
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fwhnny

金虫 (小有名气)
多谢了，我再试试看，应该不会那么霉吧
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7楼2008-03-12 13:00:58
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