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关于淀粉合成的几个酶的测定方法
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酶活测定 ADPG焦磷酸化酶（AGPP）活性测定方法 材料： 籽粒和叶片 试剂： 50mM HEPES 50mM MgCl2 5mM UDPG 20mM PPi 6mM NADP+（还原辅酶Ⅱ） 1.5IU/ml PGM(磷酸葡萄糖变位酶) 5IU/ml G-6-PDH（6-磷酸葡萄糖脱氢酶） 50mM DTT 测定步骤 1、 取干净的小试管分别加入 100ul 5mM UDPG 50ul 50mM MgCl2 120ul Hepes-NaOH 50ul 50mM DTT 100ul 20mM PPi 30μL 酶液 2、 混匀后，30℃保温反应10min（反应时间）（反应时间可以做预试） 3、 沸水浴1 min 终止反应 4、 冷却至30℃后，加入100ul 6mM NADP+；50ul PGM；50ul G-6-PDH和0.3mlHepes-NaOH 5、 混匀后，30℃保温10min 6、 340nm 比色 7、以单位重量每分钟产生的NADPH量为酶活性单位。 比色体积为950ul 蔗糖合成酶（SS）活性的测定（合成方向） 材料： 1、合成方向 叶片 试剂： 1、HEPES提取缓冲液 50mM pH=7.5 2、50mM UDPG 3、10mM Mgcl2 4、50mM F（果糖） 5、2N NaOH 6、30% HCl 7、1% 间苯二酚（用酒精配制） 测定步骤： 1、 取干净的小试管分别加入： 100ul HEPES-NaOH 缓冲液 50ul 10mM MgCl2 100ul 50mM UDPG 100ul 50mM F 200ul 酶液 2、混匀，30℃保温 30 min （反应时间） 3、100℃ 水浴 1min 杀死 4、加入200ul 2N NaOH 混匀 5、100℃加热10min 6、加入2ml 30% HCl 和1ml 1% 间苯二酚 7、混匀后80℃保温10min 8、冷却后 480nm比色 蔗糖标准曲线的制作： 精确称取烘干的蔗糖0.6846g，定容100ml，再取1ml；稀释成100ml 蔗糖合成酶（SS）活性的测定（降解方向） 材料： 降解方向：小麦籽粒 试剂： 反应介质： 内含：50mM HEPES-NaOH 300mM 蔗糖 10mM UDP 3,5-二硝基水杨酸试剂 测定步骤： 基础还原糖量： 1、取20ul（或50ul）酶液 2、沸水浴1min杀死酶活性 3、冷却后加入1.98ml(如果是50ul酶液，就加1.95ml)水和1.5ml 3，5-二硝基水杨酸 4、混匀后，沸水浴5min 5、冷却后540nm比色得比值（1） 酶活性测定： 1、200ul 反应介质加入20ul（是不是可以考虑取50ul）酶液，混匀 2、30℃保温20min(反应时间) 3、沸水浴1min终止反应 4、冷却后加入1.78ml(如果是50ul酶液，就加1.75ml)水和1.5ml 3，5-二硝基水杨酸 5、混匀后，沸水浴5min 6、冷却后540nm比色得比值（2） 比值（2）-比值（1）即为酶反应反产生的还原糖 以葡萄糖做标准曲线 |
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