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秦之故都

铜虫 (初入文坛)

[资源] 关于淀粉合成的几个酶的测定方法

酶活测定
ADPG焦磷酸化酶（AGPP）活性测定方法
材料：
籽粒和叶片
试剂：
50mM  HEPES
50mM  MgCl2
5mM UDPG
20mM  PPi
6mM NADP+（还原辅酶Ⅱ）
1.5IU/ml  PGM(磷酸葡萄糖变位酶)
5IU/ml G-6-PDH（6-磷酸葡萄糖脱氢酶）
50mM  DTT
测定步骤
1、取干净的小试管分别加入
100ul  5mM UDPG
50ul 50mM  MgCl2
120ul  Hepes-NaOH
50ul 50mM  DTT
100ul  20mM  PPi
30μL 酶液
2、混匀后，30℃保温反应10min（反应时间）（反应时间可以做预试）
3、沸水浴1 min 终止反应
4、冷却至30℃后，加入100ul 6mM NADP+；50ul PGM；50ul G-6-PDH和0.3mlHepes-NaOH
5、混匀后，30℃保温10min
6、 340nm 比色
7、以单位重量每分钟产生的NADPH量为酶活性单位。
比色体积为950ul

蔗糖合成酶（SS）活性的测定（合成方向）
材料：
1、合成方向  叶片
试剂：
1、HEPES提取缓冲液 50mM  pH=7.5
2、50mM  UDPG
3、10mM  Mgcl2
4、50mM  F（果糖）
5、2N  NaOH
6、30% HCl
7、1%  间苯二酚（用酒精配制）
测定步骤：
1、取干净的小试管分别加入：
100ul HEPES-NaOH 缓冲液
50ul  10mM  MgCl2
100ul 50mM  UDPG
100ul 50mM  F
200ul  酶液
2、混匀，30℃保温 30 min （反应时间）
3、100℃ 水浴 1min 杀死
4、加入200ul 2N NaOH 混匀
5、100℃加热10min
6、加入2ml 30% HCl 和1ml 1% 间苯二酚
7、混匀后80℃保温10min
8、冷却后 480nm比色

蔗糖标准曲线的制作：
精确称取烘干的蔗糖0.6846g，定容100ml，再取1ml；稀释成100ml
蔗糖合成酶（SS）活性的测定（降解方向）
材料：
降解方向：小麦籽粒
试剂：
反应介质：
内含：50mM  HEPES-NaOH
   300mM  蔗糖
   10mM UDP
3,5-二硝基水杨酸试剂
测定步骤：
基础还原糖量：
1、取20ul（或50ul）酶液
2、沸水浴1min杀死酶活性
3、冷却后加入1.98ml(如果是50ul酶液，就加1.95ml)水和1.5ml 3，5-二硝基水杨酸
4、混匀后，沸水浴5min
5、冷却后540nm比色得比值（1）
酶活性测定：
1、200ul 反应介质加入20ul（是不是可以考虑取50ul）酶液，混匀
2、30℃保温20min(反应时间)
3、沸水浴1min终止反应
4、冷却后加入1.78ml(如果是50ul酶液，就加1.75ml)水和1.5ml 3，5-二硝基水杨酸
5、混匀后，沸水浴5min
6、冷却后540nm比色得比值（2）
比值（2）-比值（1）即为酶反应反产生的还原糖
以葡萄糖做标准曲线

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