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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 设计realtimePCR引物的问题
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yuyixst

木虫 (正式写手)

[交流] 设计realtimePCR引物的问题

我在设计rtpcr引物时候对一句话不是很理解，就是为了避免基因组的扩增，引物设计最好跨两个外显子，这是什么意思，请指导！！！！
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1楼 2008-03-02 12:52:51
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forget1997

银虫 (小有名气)
2，3楼说的没错，跨越两个外显子是为了去除DNA污染。但不是很完全。也不是为了去除蛋白质。
测量基因表达的时候，一般是先提取total RNA然后逆转录为cDNA。可是现在所有的RNA提取方法都无法保证完全去除DNA，包括加入DNA酶。
如果存在DNA，而且你的引物都在一个外显子上，除了cDNA，DNA也会被扩出来，从而影响你realtimePCR的准确性。
为了去除DNA污染，将引物放在两个不同的外显子上。外显子通常其跨度超过数k的内含子。这样在一般情况下，DNA是无法扩增的。
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5楼2008-03-02 14:31:16
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playboy723

金虫 (正式写手)
如果跨内含子的话   那么扩出来的产物大小要比不跨内含子的大很多   这样从产物片段大小就能看出有无基因组DNA的污染     呵呵   假如不跨内含子   谁知道你扩出来的是什么啊   你能说情吗？
呵呵     这是绝密消息    一般人不愿意讲  因为我傻所以告诉你
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3楼2008-03-02 13:58:10
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ganchao1776

至尊木虫 (职业作家)
real time-pcr 叫实时荧光定量pcr
主要用于模板的定量分析

一个外显子可用于有相近或相似功能的不同蛋白质，这些蛋白的基因又在同一个基因组上，如果引物设计在一个外显子上，那么你定出来的量就有可能是几种蛋的的基因的和，把引物设计在两个外显子上就大在大降低了这个可能

说了这么多，其实和2楼的是一个意思！只是把原因给你说了一下而已！！
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4楼2008-03-02 14:20:38
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ganchao1776

至尊木虫 (职业作家)
3楼说的也有道理，但是如果你的蛋白大的话，别跨的太多了，跨太多了你批的基因就很很大，需要的退火时间就会很长，做了20来个循环TAQ酶就不行了，S型线早早的就来了，有可能线性不好
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6楼2008-03-02 14:34:06
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