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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 细胞科学 » 细胞培养
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weiing

铜虫 (小有名气)

[交流] 细胞培养

本人在实验室培养过程中，前期细胞密度均处于非常好的状态，细胞活率也一直维持在98%以上，在培养最后一天,细胞活率极具下降，一天之内从98%下降到60%左右，培养结束，整个培养基本无平台期，导致产量受到影响。

细胞株：CHO-S
基础培养基：商业化培养基
补料培养基：商业化培养基
接种密度：0.4-0.6*10^6cells/mL
最高细胞密度（day7-8）13*10^6cells/mL
达到细胞最高密度后能维持1-2天后，细胞大量死亡。

已做工作：降温（降温对延长时间无改善）
          氨基酸分析（现有数据表明氨基酸均处于比较合理状态，至少没有极度缺乏氨基酸）
          增加补料体积（无改善）
          在基础与补料中加植物水解物（微量增加产量，但对于培养时间延长无影响）
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1楼 2014-04-09 22:41:25
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wangyue115

木虫 (正式写手)

冰山火种
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
楼主的细胞培养几天后活率下降？
不管是哪种细胞，培养几天后，状态都会变差，此时需要重新传代。没有哪种细胞可以维持数天状态依然良好。
对于大多数CHO细胞来说，三天后细胞状态都会下降，楼主已经做到七八天，已经是相当长的时间了。
如果细胞密度已经够高了，就可以传代并扩大体系，或者冻存备用。
如果细胞密度不高，可以考虑消化贴壁细胞，离心换新培养基，让细胞重新贴壁生长，有可能会改善状态。
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2楼2014-04-10 06:15:53
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weiing

铜虫 (小有名气)
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2楼: Originally posted by wangyue115 at 2014-04-10 06:15:53
楼主的细胞培养几天后活率下降？
不管是哪种细胞，培养几天后，状态都会变差，此时需要重新传代。没有哪种细胞可以维持数天状态依然良好。
对于大多数CHO细胞来说，三天后细胞状态都会下降，楼主已经做到七八天， ...

是细胞培养表达蛋白，用的Fed-batch工艺。
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3楼2014-04-10 08:22:13
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wangyue115

木虫 (正式写手)

冰山火种
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引用回帖:
3楼: Originally posted by weiing at 2014-04-10 08:22:13
是细胞培养表达蛋白，用的Fed-batch工艺。...

你用的是驯化过的细胞吗？培养基里有血清吗？如果是驯化过的细胞，说明驯化的不是太成功。如果是有血清的，可以考虑调整血清浓度。
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4楼2014-04-11 13:40:25
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wangyue115

木虫 (正式写手)

冰山火种
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3楼: Originally posted by weiing at 2014-04-10 08:22:13
是细胞培养表达蛋白，用的Fed-batch工艺。...

再问一下，你现在用的是什么容器？滚瓶？细胞罐？
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5楼2014-04-11 13:42:03
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weiing

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by wangyue115 at 2014-04-11 13:42:03
再问一下，你现在用的是什么容器？滚瓶？细胞罐？...

细胞罐

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6楼2014-04-11 20:53:10
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wangyue115

木虫 (正式写手)

冰山火种
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
3楼: Originally posted by weiing at 2014-04-10 08:22:13
是细胞培养表达蛋白，用的Fed-batch工艺。...

你用的是驯化过的细胞吗？培养基里有血清吗？如果是驯化过的细胞，说明驯化的不是太成功。如果是有血清的，可以考虑调整血清浓度。
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7楼2014-04-12 01:52:05
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小周

铁杆木虫 (著名写手)
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weiing: 金币+5 2014-04-15 08:30:29
看你的数据，你的细胞生长是没有问题的，Max Vc 也可以。
你的这株细胞在 simple batch 培养时的状态怎么样，在培养的后期会不会突然死亡？
细胞生产的蛋白是什么？ 对细胞有毒性吗？

没有看到你的Gluc 和Gln 的数据，这两个在培养后期耗尽了吗？

如果没有以上问题，说明这是这株细胞的特性。我以前遇到过CHO-S来源的细胞是这个样子，在培养的后期“猝死”。针对这种细胞做工艺，我认为主要提高细胞的 Max Vc ,延长细胞的生长时间。

另外，我想问一下你的降温时怎么做的，怎么会没有作用呢？
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8楼2014-04-12 09:31:34
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weiing

铜虫 (小有名气)
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8楼: Originally posted by 小周 at 2014-04-12 09:31:34
看你的数据，你的细胞生长是没有问题的，Max Vc 也可以。
你的这株细胞在 simple batch 培养时的状态怎么样，在培养的后期会不会突然死亡？
细胞生产的蛋白是什么？ 对细胞有毒性吗？

没有看到你的Gluc 和Gln  ...

第一：细胞密度有继续上升的空间，主要是死的太快用温度限制其生长了。
第二：细胞生长的为抗体，一般经验而言对细胞没有毒性
第三：葡萄糖是肯定没有耗尽的，gln是一直有流加，但是glumate一直在累积，证明不能进入TCA循环，实际上流加多了。
第四：后期猝死，我觉得还是营养不够，不知道是那种限制性成分
第五：CHO-S对温度不敏感，即使降温到32度，其倍增时间也不超过20小时，但是比较影响表达。也会在后期出现猝死现象。
降温常规这做做的：一般让细胞长到一定密度（由批培养稍微摸一下数据0），然后降温让维持一定密度，也慢慢死下去。但是这个不符合该情况
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9楼2014-04-13 20:36:38
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小周

铁杆木虫 (著名写手)
★
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9楼: Originally posted by weiing at 2014-04-13 20:36:38
第一：细胞密度有继续上升的空间，主要是死的太快用温度限制其生长了。
第二：细胞生长的为抗体，一般经验而言对细胞没有毒性
第三：葡萄糖是肯定没有耗尽的，gln是一直有流加，但是glumate一直在累积，证明不能 ...

根据你的推论，细胞猝死是因为某一种或几种营养成分的缺乏。它（它们）在基础培养基中存在，而补料培养基中缺乏，或是没有，因此造成了培养后期营养的缺乏。
换种补料培养基试试。

取少量培养后期细胞（猝死前一两天），离心后，用等量基础培养基重悬一下，放摇瓶中培养，看看细胞会不会死。不处理的做对照。（该方法不一定能行，细胞可能已经进入凋亡）
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10楼2014-04-13 21:23:52
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