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weiing

铜虫 (小有名气)

[交流] 细胞培养

本人在实验室培养过程中,前期细胞密度均处于非常好的状态,细胞活率也一直维持在98%以上,在培养最后一天,细胞活率极具下降,一天之内从98%下降到60%左右,培养结束,整个培养基本无平台期,导致产量受到影响。

细胞株:CHO-S
基础培养基:商业化培养基
补料培养基:商业化培养基
接种密度:0.4-0.6*10^6cells/mL
最高细胞密度(day7-8)13*10^6cells/mL
达到细胞最高密度后能维持1-2天后,细胞大量死亡。

已做工作:降温(降温对延长时间无改善)
          氨基酸分析(现有数据表明氨基酸均处于比较合理状态,至少没有极度缺乏氨基酸)
          增加补料体积(无改善)
          在基础与补料中加植物水解物(微量增加产量,但对于培养时间延长无影响)
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wangyue115

木虫 (正式写手)

冰山火种


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
楼主的细胞培养几天后活率下降?
不管是哪种细胞,培养几天后,状态都会变差,此时需要重新传代。没有哪种细胞可以维持数天状态依然良好。
对于大多数CHO细胞来说,三天后细胞状态都会下降,楼主已经做到七八天,已经是相当长的时间了。
如果细胞密度已经够高了,就可以传代并扩大体系,或者冻存备用。
如果细胞密度不高,可以考虑消化贴壁细胞,离心换新培养基,让细胞重新贴壁生长,有可能会改善状态。
2楼2014-04-10 06:15:53
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weiing

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by wangyue115 at 2014-04-10 06:15:53
楼主的细胞培养几天后活率下降?
不管是哪种细胞,培养几天后,状态都会变差,此时需要重新传代。没有哪种细胞可以维持数天状态依然良好。
对于大多数CHO细胞来说,三天后细胞状态都会下降,楼主已经做到七八天, ...

是细胞培养表达蛋白,用的Fed-batch工艺。
3楼2014-04-10 08:22:13
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wangyue115

木虫 (正式写手)

冰山火种


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
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3楼: Originally posted by weiing at 2014-04-10 08:22:13
是细胞培养表达蛋白,用的Fed-batch工艺。...

你用的是驯化过的细胞吗?培养基里有血清吗?如果是驯化过的细胞,说明驯化的不是太成功。如果是有血清的,可以考虑调整血清浓度。
4楼2014-04-11 13:40:25
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wangyue115

木虫 (正式写手)

冰山火种

引用回帖:
3楼: Originally posted by weiing at 2014-04-10 08:22:13
是细胞培养表达蛋白,用的Fed-batch工艺。...

再问一下,你现在用的是什么容器?滚瓶?细胞罐?
5楼2014-04-11 13:42:03
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weiing

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
5楼: Originally posted by wangyue115 at 2014-04-11 13:42:03
再问一下,你现在用的是什么容器?滚瓶?细胞罐?...

细胞罐

[ 发自小木虫客户端 ]
6楼2014-04-11 20:53:10
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wangyue115

木虫 (正式写手)

冰山火种


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引用回帖:
3楼: Originally posted by weiing at 2014-04-10 08:22:13
是细胞培养表达蛋白,用的Fed-batch工艺。...

你用的是驯化过的细胞吗?培养基里有血清吗?如果是驯化过的细胞,说明驯化的不是太成功。如果是有血清的,可以考虑调整血清浓度。
7楼2014-04-12 01:52:05
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小周

铁杆木虫 (著名写手)

★ ★ ★ ★ ★ ★
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weiing: 金币+5 2014-04-15 08:30:29
看你的数据,你的细胞生长是没有问题的,Max Vc 也可以。
你的这株细胞在 simple batch 培养时的状态怎么样,在培养的后期会不会突然死亡?
细胞生产的蛋白是什么? 对细胞有毒性吗?

没有看到你的Gluc 和Gln 的数据,这两个在培养后期耗尽了吗?

如果没有以上问题,说明这是这株细胞的特性。我以前遇到过CHO-S来源的细胞是这个样子,在培养的后期“猝死”。针对这种细胞做工艺,我认为主要提高细胞的 Max Vc ,延长细胞的生长时间。

另外,我想问一下你的降温时怎么做的,怎么会没有作用呢?
8楼2014-04-12 09:31:34
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weiing

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
8楼: Originally posted by 小周 at 2014-04-12 09:31:34
看你的数据,你的细胞生长是没有问题的,Max Vc 也可以。
你的这株细胞在 simple batch 培养时的状态怎么样,在培养的后期会不会突然死亡?
细胞生产的蛋白是什么? 对细胞有毒性吗?

没有看到你的Gluc 和Gln  ...

第一:细胞密度有继续上升的空间,主要是死的太快用温度限制其生长了。
第二:细胞生长的为抗体,一般经验而言对细胞没有毒性
第三:葡萄糖是肯定没有耗尽的,gln是一直有流加,但是glumate一直在累积,证明不能进入TCA循环,实际上流加多了。
第四:后期猝死,我觉得还是营养不够,不知道是那种限制性成分
第五:CHO-S对温度不敏感,即使降温到32度,其倍增时间也不超过20小时,但是比较影响表达。也会在后期出现猝死现象。
降温常规这做做的:一般让细胞长到一定密度(由批培养稍微摸一下数据0),然后降温让维持一定密度,也慢慢死下去。但是这个不符合该情况
9楼2014-04-13 20:36:38
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小周

铁杆木虫 (著名写手)


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引用回帖:
9楼: Originally posted by weiing at 2014-04-13 20:36:38
第一:细胞密度有继续上升的空间,主要是死的太快用温度限制其生长了。
第二:细胞生长的为抗体,一般经验而言对细胞没有毒性
第三:葡萄糖是肯定没有耗尽的,gln是一直有流加,但是glumate一直在累积,证明不能 ...

根据你的推论,细胞猝死是因为某一种或几种营养成分的缺乏。它(它们)在基础培养基中存在,而补料培养基中缺乏,或是没有,因此造成了培养后期营养的缺乏。
换种补料培养基试试。

取少量培养后期细胞(猝死前一两天),离心后,用等量基础培养基重悬一下,放摇瓶中培养,看看细胞会不会死。不处理的做对照。(该方法不一定能行,细胞可能已经进入凋亡)
10楼2014-04-13 21:23:52
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