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windflee

铁虫 (小有名气)

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专业: 药物、基因载体系统

[求助] PEI25k介导外源pORF-Lacz基因转染HepG2细胞不成功

本人轻化工程出身，研究专业是高分子材料，研究方向主要是基因转染。可能和新手原因有关，实验诸多不顺，特求助。
   前段时间合成了两种基因转染用载体，并和PEI25k进行了转染的比较，已经反复做了很多次了，但一直没有得到可用的数据。特别诡异的是经典体系PEI25k也没能转染出来，心中也是特别焦急，不知从何下手。
   我的过程如下：
   在24孔板中分为7组，每组设3复孔。给药条件及细胞生长状态见下表：
组别给药条件细胞摄取4h后状态继续培养48h后状态
BLANK 加入50μL的PBS溶液良好长满
PEI25-2 N/P=15，c(Lacz)=4μg/mL 大部分死亡大部分死亡
PEI25-1 N/P=15，c(Lacz)=2μg/mL 良好长满
GNPS-2 N/P=15，c(Lacz)=4μg/mL 良好长满
GNPS-1 N/P=15，c(Lacz)=2μg/mL 良好长满
GNRS-2 N/P=15，c(Lacz)=4μg/mL 良好长满
GNRS-1 N/P=15，c(Lacz)=2μg/mL 良好长满
转染过程：细胞接24孔板后，当生长至70%～80%融合时，用PBS清洗两次，每孔加入0.5mL培养基（无血无抗）。接着每孔加入相应的共50μL的DNA/载体复合物（用无血无清抗生素1640培养基配制，孵育30min），培养4h后，更换完全培养基继续培养48h。
接着对细胞转染结果进行分析，加Ripa裂解液100μL,然后分别测单位体积细胞裂解液的β-gal活性及总蛋白含量。每孔的总蛋白含量是正常的，大多数的组都超过了0.5μg/μL,不过β-gal活性普遍较低，均在0.06-0.1mU/μL范围内，转染结果相当不理想。因为PEI25-2组细胞大部分死亡，结果已失真，这里就不作比较了。转染率的表示方法为每mg蛋白中β-gal的活性单位数，结果如下所示：

平均值(mU/mg) 标准差（mU/mg）
blank 23.19113 3.036485
GNPS-2 43.63505 10.42721
GNRS-2 69.20421 8.292071
PEI25-1 63.88245 7.986505
GNPS-1 12.92375 0.071804
GNRS-1 30.30228 7.590619
另外，对不同载体进行了MTT毒性测试，发现细胞的耐受性似乎差了很多，不知道是不是细胞原因造成的。
现在，实验陷入了瓶颈期，我大致罗列了一下原因，可能有以下几方面：
1、细胞的状态不佳，不能很好地表达外源基因（可能和细胞接板前已汇合成片、细胞本身状态有关）
2、DNA/载体复合物形成不佳，DNA没能很好地转运到细胞内部
3、培养时间过长，比较疑惑吧。因为这样的转染肯定是属于瞬时转染，报道称24h-96h都应该是合适的，难道不同细胞的最适时间不同么
4、做实验的心情太糟，细胞就变相报复了

我想说，有没有哪位大侠可以拯救下我呀，因为实验一直失败的感觉真的很难受。这已经是我第六次做转染了，我找了好久原因，但是问题出在哪呢？现在当务之急是PEI25k必须得出正常的结果，要不然接下来的实验没法做了。感谢各位了

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