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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 添加酶切位点的引物设计问题
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yuyixst

木虫 (正式写手)

[交流] 添加酶切位点的引物设计问题

如题，要设计这样的引物是应该先设计出找出理想的引物，然后再添加酶切位点和保护碱基，然后PCR条件应该是按添加之前的软件给出的条件吗？？还是应该在添加酶切位点后推算它的条件？？语言表达有点混乱我自己。
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1楼 2008-02-25 18:51:56
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guohuayin

木虫 (著名写手)

博士，副教授
★
reasonspare(金币+1,VIP+0):THX, BAN BAN
在设计PCR反应条件时，不要考虑所添加酶切位点和保护碱基，你可以先用小体系扩增摸索好条件后，再正式扩增。
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内生菌资源和核酸分子的利用
2楼2008-02-26 06:49:58
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yuyixst

木虫 (正式写手)
楼上的还是没有明白我的意思....苦恼
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3楼2008-02-26 08:34:59
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mascotte

金虫 (正式写手)
退火温度按添加之前的算。而且温度低于理论温度比较容易批
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4楼2008-02-26 08:52:14
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zhjcao

木虫 (小有名气)
★ ★
reasonspare(金币+0,VIP+0):THX
reasonspare(金币+2,VIP+0):THX
你要要扩增一个完整基因吗?
如果是的话就要在起始密码子前加几个碱基（也就是内切酶识别的序列），但有一点要注意，你加的酶切位点序列，基因内部不能有的。同时有些酶还要在5`端多几个多余的碱基，切割效率才会高的。
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5楼2008-02-26 09:00:29
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wangjun0457

银虫 (小有名气)
★
reasonspare(金币+1,VIP+0):THX
我觉得关键在于模板。如果模板是质粒，那怎么干都行。如果是来自基因组DNA，那就可能麻烦一些。
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6楼2008-02-26 10:20:33
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yuyixst

木虫 (正式写手)
谢谢各位了..为什么基因组DNA麻烦呢？
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7楼2008-02-26 15:28:45
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ganchao1776

至尊木虫 (职业作家)
★ ★
reasonspare(金币+2,VIP+0):xiexie 欢迎常来,.兄弟很热心.而且很有幽默,但是不要让人误会你的意思.
引用回帖:
Originally posted by yuyixst at 2008-2-26 15:28:
谢谢各位了..为什么基因组DNA麻烦呢？

基因组太大了，会有一些与你的引物相似的序列，基因组的结构也太复杂了，用你的引物批的时候特异性不强，有的时候会出来大小不同的好几个条带，有的时候会出现很宽的亮带，宽到从胶孔到最前沿都是亮的，有的时候什么也没有，这个是通过优化PCR条件无法改变的，唯独不会出现的一种情况就是：出现了一条亮带，如果出现了那么你很走运，建议你去买几注彩票！！
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8楼2008-02-26 20:56:31
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yuyixst

木虫 (正式写手)
多想楼上各位...拜谢
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9楼2008-02-27 08:57:31
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GinTonic

金虫 (小有名气)
唉我也要做了
不知道我的运气好不好啊
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10楼2008-03-06 01:02:40
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