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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » Red同源重组
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预防凯凯

新虫 (初入文坛)

[求助] Red同源重组 已有2人参与

我用Red同源重组的方法缺失沙门氏菌的氟苯尼考耐药基因floR，但是在转pKD4的时候老是打靶不进去，这是为什么？我的打靶引物是50bp的同源臂+20bp的卡那霉素的抗性基因引物，这跟floR基因有关吗？ 这个基因是质粒上有染色体上也有？ 有高手吗，求助啊
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1楼 2014-03-24 20:25:07
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fenghan06

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

我倒是有几个意见

1/ 延长你做37C recovery的时间到三个小时， 原始文献使用1个小时， 那个其实效果不是很好。
2/ 确认你用的糖是L＋ Arabinose, 如果你用的是D， 或则是L －， 换一瓶吧。
3/ 浓缩PCR产物时候， 过柱子时候， 用水不要用TE.
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11楼2015-05-25 13:17:05
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yixibiyu

铁杆木虫 (正式写手)
我最开始做的时候也总是做不出来不，但有几点你得注意：
   1. 电转的条件，包括电压和时间；
   2. 敲入片段的浓度，尽量浓一些；
此外，板上的抗性你可以少加一些，我当时用的是25ug/ml的量。

因为我们做的菌种不同，所以以上意见仅供参考。
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2楼2014-03-26 19:02:00
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d00614028

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
虽然Red的理论重组臂在50bp就满足了，但还是设长点比较好，加长重组臂在200bp。
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3楼2014-03-27 10:28:43
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预防凯凯

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by yixibiyu at 2014-03-26 19:02:00
我最开始做的时候也总是做不出来不，但有几点你得注意：
   1. 电转的条件，包括电压和时间；
   2. 敲入片段的浓度，尽量浓一些；
此外，板上的抗性你可以少加一些，我当时用的是25ug/ml的量。

因为我们做的 ...

嗯，好的，谢谢，我的是2000V，5ms，打靶片段浓度为200-400ng/uL，感觉挺高了啊
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4楼2014-03-27 22:06:03
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