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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 求助！！NI亲和层析纯化
北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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toyou312

新虫 (初入文坛)

[交流] 求助！！NI亲和层析纯化

我做的是外源蛋白的原核表达与纯化。
使用的表达载体是pET32，融合蛋白：融合Trx，带有6*His标签，设计有肠激酶酶切位点。简式：Trx--6*His--肠激酶位点--目的蛋白。
蛋白表达后，先用NI亲和层析树脂吸附融合蛋白，用50mM、100mM、150mM咪唑缓冲液洗脱蛋白，收集融合蛋白。透析出去缓冲液，用肠激酶酶切，生成Trx--6*His--肠激酶位点和目的蛋白。然后再次用NI亲和层析树脂吸附Trx--6*His--肠激酶位点,留下目的蛋白。将目的蛋白冷冻干燥浓缩，SDS-PAGE检测。
检测发现，收集的融合蛋白主要在50mM、100mM咪唑缓冲液时洗出，以融合蛋白为主，但是存在少量杂蛋白，因为以后蛋白要用于药用，老板要求纯度要高，怎么除去？
更主要的是第二次亲和层析后收集到的目的蛋白，经过冷冻干燥后，存在大量杂蛋白，目的蛋白含量还达不到50%。我的目的蛋白分子量4200D，不太容易分离纯化，不知道大家有没有好的有效的方法，至少也要把目的蛋白弄到电泳纯吧！！
谢谢各位高手！！
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1楼 2008-02-19 20:22:39
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wujiequn

捐助贵宾 (小有名气)
★
reasonspare(金币+1,VIP+0):xiexie 欢迎常来,.
把最后的蛋白过凝胶柱S200或S300，一切问题都可以解决。
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2楼2008-02-19 20:58:09
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superwheat

银虫 (正式写手)
★
reasonspare(金币+1,VIP+0):xiexie 欢迎常来,.
制备型液相，反相柱也好分子筛也好
其实意思就是利用不同的分离原理再过一次柱，收集目标产物而已
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3楼2008-02-20 07:52:42
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)
★ ★
reasonspare(金币+1,VIP+0):thx
先用低于50mM咪唑缓冲液洗去未结合和结合能力弱的杂蛋白，然后用100mM或者更高浓度咪唑缓冲液洗脱出融合蛋白，而且最后应该还要除去肠激酶。
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4楼2008-02-20 10:54:40
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wangjun0457

银虫 (小有名气)
Pharmacia有一款分离小肽用的分子筛柱，也许可以试试。
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5楼2008-02-26 14:06:19
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xyfu

金虫 (小有名气)
★
reasonspare(金币+1,VIP+0):xiexie 欢迎常来,.
一些硫氧还融合蛋白能够继承硫氧还蛋白的热稳定性，先考察一下你的硫氧还融合蛋白是否有热稳定性，如果有，可以先热处理除去大部分杂蛋白
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6楼2008-03-01 15:03:52
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skkyy88888

铜虫 (著名写手)
★
reasonspare(金币+1,VIP+0):xiexie,
超滤后结合着离子株继续纯化，效果明显。
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7楼2008-03-01 15:22:57
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ganchao1776

至尊木虫 (职业作家)
你的目的蛋白也太小了，还不能40个氨基酸，也只能叫多肽了吧！？

Trx上没有肠激酶酶切位点吧，有的话你的方案就要从头来了！

如果不是我上面说的，那你纯化的问题主要集中在第一次过NI柱，建议你上样量再少一点，50mM多洗一会儿，这样能保证杂蛋白与融合蛋白"彻底"分开
另外按你的实验方案肠激酶肯定在你最后的产品中的，你要主意不要让这个成了你产品中杂质的主要成份
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8楼2008-03-02 13:39:52
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jfchang

新虫 (初入文坛)
去除杂蛋白的方案最好是在洗涤阶段提高NaCl浓度，最高可以提高到250mM，洗涤杂蛋白的效果很明显。另外，50，100mM咪唑也可以显著的降低杂蛋白背景污染，但如你上面所述，你的目的蛋白已经在这两个浓度下洗脱下了，所以最佳方案还是在洗涤液中提高NaCl浓度，降低咪唑浓度，这样可能有助于避免杂蛋白的污染。
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9楼2008-03-04 11:47:32
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