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求助！！NI亲和层析纯化
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我做的是外源蛋白的原核表达与纯化。 使用的表达载体是pET32，融合蛋白：融合Trx，带有6*His标签，设计有肠激酶酶切位点。简式：Trx--6*His--肠激酶位点--目的蛋白。 蛋白表达后，先用NI亲和层析树脂吸附融合蛋白，用50mM、100mM、150mM咪唑缓冲液洗脱蛋白，收集融合蛋白。透析出去缓冲液，用肠激酶酶切，生成Trx--6*His--肠激酶位点和目的蛋白。然后再次用NI亲和层析树脂吸附Trx--6*His--肠激酶位点,留下目的蛋白。将目的蛋白冷冻干燥浓缩，SDS-PAGE检测。 检测发现，收集的融合蛋白主要在50mM、100mM咪唑缓冲液时洗出，以融合蛋白为主，但是存在少量杂蛋白，因为以后蛋白要用于药用，老板要求纯度要高，怎么除去？ 更主要的是第二次亲和层析后收集到的目的蛋白，经过冷冻干燥后，存在大量杂蛋白，目的蛋白含量还达不到50%。我的目的蛋白分子量4200D，不太容易分离纯化，不知道大家有没有好的有效的方法，至少也要把目的蛋白弄到电泳纯吧！！ 谢谢各位高手！！ |
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