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weiyuanzheng

铜虫 (小有名气)

[交流] 带T7启动子的体外转录效率

各位老师，各位师兄师姐，最近我一直在做体外转录，用的是life 的mMESSAGE mMACHINE® Kit体外转录试剂盒，但是转录的RNA量很低，大概只有50ng/ul的样子，纯度可以。我做了阳性对照，提高了转录模版浓度，但是结果还是不理想。同时我又把转录模版拿去测序，发现T7启动子区域完全正确！！5‘端设置了3个保护碱基，应该说没问题的，急盼各位亲们多多指导，谢谢啦。
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1楼2014-03-10 08:58:37
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仙人掌的龟

新虫 (初入文坛)
我也有这个问题！请问您在37度放置两小时后，可以在EP 管中看到白色的沉淀物吗？
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2楼2014-03-15 02:24:05
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weiyuanzheng

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 仙人掌的龟 at 2014-03-15 02:24:05
我也有这个问题！请问您在37度放置两小时后，可以在EP 管中看到白色的沉淀物吗？

看不到呀，嘿嘿，不过还好吧，可能是转录效率的问题，我的已经解决了，你也加油哦，祝实验顺利！
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3楼2014-03-15 15:53:15
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biostar2009

专家顾问 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 仙人掌的龟 at 2014-03-15 02:24:05
我也有这个问题！请问您在37度放置两小时后，可以在EP 管中看到白色的沉淀物吗？

这个经常能够看见，尤其是使用PCR为模板的时候，质粒为模板见到的概率较低。我的理解可能是两个方面的原因，如果是一层紧贴EP管下端的白色沉淀，感觉很致密的，应该是DNA模板沉淀了，因为转录体系中有精胺，这个东西可以导致DNA沉淀。如果是整体的浑浊，可能是转录出来的RNA含量很丰富。但是不管如何，这一点并不影响转录的效率。
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4楼2014-03-17 17:16:33
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呼锐

金虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by weiyuanzheng at 2014-03-15 15:53:15
看不到呀，嘿嘿，不过还好吧，可能是转录效率的问题，我的已经解决了，你也加油哦，祝实验顺利！...

具体怎么做的 学习一下呗
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5楼2014-04-08 13:28:55
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hrjailjg

新虫 (初入文坛)
请问您质粒模板切多少ug
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6楼2014-11-23 02:46:03
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