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Engle_shen金虫 (小有名气)
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[求助]
请问是否可以直接对抗原进行染色呢？ 已有1人参与
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| 本人做材料出身，最近发现一种新材料，想做个最基本的免疫识别反应，请问是否可以对抗原进行染色，然后与抗体进行识别，当然大多数情况都是对抗体进行染色，识别抗原，不过俺想逆转下，请高手指教，是否FITC可以像对抗体样，对抗原进行染色，谢谢 |
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yipan 
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【答案】应助回帖
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Engle_shen(kx444555代发): 金币+5, 鼓励交流 2014-02-27 09:04:05
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流式表面抗原染色方法 方案A：细胞悬液的表面抗原染色。 方案B：一步法胞内蛋白染色（细胞核）。 小贴士： 1、流式抗体要储存于避光4度，严格避免冻融。 2、流式抗体使用前要离心3min，避免贴壁盖的损失，请勿斡旋混匀。 3、避免细胞成团，以免堵塞流式细胞仪。 4、eFluor纳米晶体抗体参照该品说明进行改善。 方案A: 细胞悬液的表面抗原染色 实验材料： 15×75mm圆底流式管或96孔板 直标一抗或纯化抗体 二抗（可选） 抗小鼠CD32/16抗体（eBioscience Cat. No. 14-0161） 人FCR结合抑制剂（eBioscience Cat. No. 14-9161） 流式染色液（eBioscience Cat. No. 00-4222）可自行配制 eFluor纳米晶体抗体染色液（eBioscience Cat. No. 00-3222；可选） 7-AAD活度染色液（eBioscience Cat. No. 00-6993）或PI染色液（eBioscience Cat. No. 00-6990） 实验流程： 1、按照样品细胞制备方案制备悬浮细胞，调整浓度为2×107/ml。 2、（可选）封闭FCR介导的非特异性反应： 小鼠：染色之前加0.5ug-1ug/100ul CD16/32抗体，孵育20min。 人类：染色之前加20ul 人FCR结合抑制剂孵育20min。 3、等分细胞悬液，每管50ul，再补加50ul染色液。 4、按照抗体说明书加入适量抗体，轻弹混匀。 5、直标抗体。 方案B：淋巴组织细胞制备 实验材料： 60×15mm 的组织培养皿 [5ml 注射器 细胞过滤器（尼龙网过滤） eBioscience® 流式染色缓冲液 (eBioscience Cat. No. 00-4222) 15ml或50ml的离心管。 注意： Foxp3 Fixation/Permeabilization Concentrate 1份加3份 Diluent 稀释为工作液（1:4稀释）。 实验方案： 1、按照流式样品要求制备单细胞悬液。 2、按照流式表面染色方法标记CD3和CD4。缓冲液洗涤一次，离心完全弃上清。斡旋分散细胞。 3、加1ml Foxp3 Fixation/permeabilization 工作液，斡旋固定细胞。室温或四度避光孵育30-60min（小鼠样品最长可以四度固定18小时）。 4、每管加2ml 1×permeabilization buffer。 5、300g 室温离心5min,弃上清。 6、2ml 1×permeabilization buffer重悬细胞。 7、300g 室温离心5min,弃上清。 8、加100ul 1×permeabilization buffer 重悬细胞后，加入二抗FOXP3 （或其他胞内抗原抗体），室温避光孵育20min。 9、2ml 1×permeabilization buffer洗一次，300g 室温离心5min,弃上清。 10、加2ml 流式染色液，300g 室温离心5min,弃上清。 11、适量流式染色液重悬，即可上机检测。同行对照依照上述步骤进行。软件分析结果。 |
2楼2014-02-27 09:00:45
