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质粒提取 已有1人参与
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| 本人刚开始做基因实验 提取了菌体的质粒跑了电泳之后有三条带，经过了解是DNA的三种形态，是正常的。 但是我还有个疑问，就是如果之后我要用质粒酶切和连接，提取是呈线性状态的质粒不就没用了吗，会被切成两段的?质粒的这三种形态在之后的实验中都能用上吗，还是怎样,求大神指教 |
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求高手指点(金币+1): 谢谢参与
gyesang: 金币+5, 鼓励回帖交流！ 2014-02-18 17:57:49
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1)大质粒(大于15kb)容易受损，故应采用漫和裂解法从细胞中释放出来。将细菌悬于蔗糖等渗溶液中，然后用溶菌酶和EDTA进生处理，破坏细胞壁和细胞外膜，再加入SDS一类去污剂溶解球形体。这种方法最大限度地减小了从具有正压的细菌内部把质粒释放出来所需要的作用力。 2)可用更剧烈的方法来分离小质粒。在加入EDTA后，有时还在加入溶菌酶后让细菌暴露于去污剂，通过煮沸或碱处理使之裂解。这些处理可破坏碱基配对，故可使宿主的线状染色体DNA变性，但闭环质粒DNA链由于处于拓扑缠绕状态而不能彼此分开。当条件恢复正常时，质粒DNA链迅速得到准确配置，重新形成完全天然的超螺旋分子。 3)一些大肠杆菌菌株(如HB101的一些变种衍生株)用去污剂或加热裂解时可释放相对大量的糖类，当随后用氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心进行质粒纯化时它们会惹出麻烦。糖类会在梯度中紧靠超螺旋质粒DNA所占位置形成一致密的、模糊的区带。因此很难避免质粒DNA内污染有糖类，而糖类可抑制多种限制酶的活性。故从诸 如HB101和TG1等大肠杆菌蓖株中大量制备质粒时，不宜使用煮沸法。 4)当从表达内切核酸酶A的大肠杆菌菌株(endA+株，如HB101)中小量制备质粒时，建议不使用煮沸法。因为煮沸不能完全灭活内切核酸酶A，以后在温育(如用限制酶消化)时，质粒DNA会被降解。但如果通过一个附加步骤(用酚:氯仿进行抽提)可以避免此问题。 |
3楼2014-02-18 13:18:20
4楼2014-02-18 13:19:00
