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renkeyixin

新虫 (初入文坛)

[求助] 从hek293细胞里面克隆tumatatin，始终扩不出来，求高手指点一下 已有2人参与

从hek293细胞里面克隆tumatatin，引物和退火温度都参照文献上的，始终扩增不出目的条带，温度也换了好几个了，别人都是从hek293细胞里面能够扩增出来的，求高手指点
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1楼 2014-02-17 11:00:34
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西门吹雪170

荣誉版主 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2014-02-18 11:50:22
扩cDNA吗？如果是的话，很有可能你的模板有问题
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2楼2014-02-17 18:41:40
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renkeyixin

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 西门吹雪170 at 2014-02-17 18:41:40
扩cDNA吗？如果是的话，很有可能你的模板有问题

是的，我的RNA提的应该还可以，琼脂糖胶三条带，OD260/280也都在正常范围内，逆转录试剂盒也是用的比较新的(别人用过扩增其他的基因没有问题)，那到底是哪里除了问题？？？？你从hek293细胞里面扩增过tumstatin吗？求指点一下
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3楼2014-02-26 16:40:17
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西门吹雪170

荣誉版主 (职业作家)
引用回帖:
3楼: Originally posted by renkeyixin at 2014-02-26 16:40:17
是的，我的RNA提的应该还可以，琼脂糖胶三条带，OD260/280也都在正常范围内，逆转录试剂盒也是用的比较新的(别人用过扩增其他的基因没有问题)，那到底是哪里除了问题？？？？你从hek293细胞里面扩增过tumstatin吗？ ...

呃，我没有从hek293中扩过，建议参考其他文献，换个引物试试
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4楼2014-02-26 16:59:40
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renkeyixin

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 西门吹雪170 at 2014-02-26 16:59:40
呃，我没有从hek293中扩过，建议参考其他文献，换个引物试试...

已经换过引物了，rna也重新提过。。。还是扩不出来
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5楼2014-02-26 17:38:38
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

如果单纯是克隆tumatatin这个基因，你不一定只从293细胞里面扩增，考虑到基因表达丰度的问题，你可以多提几个细胞系的RNA，然后逆转录成cDNA，把他们mix做成pool后再扩增你的基因，这样能增加扩增出tumatatin基因的机会
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学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
6楼2014-02-26 17:56:04
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西门吹雪170

荣誉版主 (职业作家)
引用回帖:
6楼: Originally posted by gyesang at 2014-02-26 17:56:04
如果单纯是克隆tumatatin这个基因，你不一定只从293细胞里面扩增，考虑到基因表达丰度的问题，你可以多提几个细胞系的RNA，然后逆转录成cDNA，把他们mix做成pool后再扩增你的基因，这样能增加扩增出tumatatin基因的 ...

还是版主厉害
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7楼2014-02-26 19:39:39
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renkeyixin

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by gyesang at 2014-02-26 17:56:04
如果单纯是克隆tumatatin这个基因，你不一定只从293细胞里面扩增，考虑到基因表达丰度的问题，你可以多提几个细胞系的RNA，然后逆转录成cDNA，把他们mix做成pool后再扩增你的基因，这样能增加扩增出tumatatin基因的 ...

这个基因在肺肾来源的细胞系中表达，我们实验室符合要求的就只有hek293
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8楼2014-02-26 20:01:03
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renkeyixin

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by gyesang at 2014-02-26 17:56:04
如果单纯是克隆tumatatin这个基因，你不一定只从293细胞里面扩增，考虑到基因表达丰度的问题，你可以多提几个细胞系的RNA，然后逆转录成cDNA，把他们mix做成pool后再扩增你的基因，这样能增加扩增出tumatatin基因的 ...

请问版主有没有克隆过tumstatin
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9楼2014-02-26 20:13:34
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主
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9楼: Originally posted by renkeyixin at 2014-02-26 20:13:34
请问版主有没有克隆过tumstatin...

没有哦
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10楼2014-02-27 11:02:08
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