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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » 木霉转化求高手指点
汕头大学海洋科学接受调剂
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ERIC20081938

铁杆木虫 (小有名气)

[求助] 木霉转化求高手指点 已有4人参与

如题，最近一直在做木霉的PEG介导原生质体转化，用的筛选抗性是潮霉素，可是做了很多次，板上都很干净，一个都没长，下面将我的转化步骤大致说一下，求高手指点：
1 活化孢子，在摇瓶中30℃，170rpm培养约14h，让孢子萌发到一定长度。
2 制备原生质体，酶解，用的是lysingzyme （sigma）约2h，最终得到浓度约为1*108/mL的原生质体。
3 PEG介导转化，质粒浓度大于10ug，用的是25%的PEG6000。
4 上层琼脂涂布筛选平板。

可能这样说的也不是很清楚，跪求有经验的高手指点，感激不尽····
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Flytothesky```
1楼 2014-01-23 10:43:17
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ERIC20081938

铁杆木虫 (小有名气)
引用回帖:
11楼: Originally posted by cairuiabc at 2014-09-13 09:13:44
你好，我最近正在制备原生质体，但浓度一直达不到10 8/ml ，裂解酶也是用的lysingzyme （sigma），请问制原生质体时需要什么注意的地方吗？

制备原生质体，最主要的是要掌握好裂解时间，酶解时间不要太长，只要菌丝裂开就可以了···
赞一下 回复此楼
Flytothesky```
12楼2014-09-15 09:21:35
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orangeleaf

铜虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
laozuzunzhe: 金币+1, 鼓励应助！ 2014-01-24 19:20:33
觉得问题在第三步,条件或操作的原因。
3 PEG介导转化，质粒浓度大于10ug，用的是25%的PEG6000。
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工业酶-T180;AU-400FLD;B85vanguard;E3-1280v3;NH-D9L;8GBx2;R7-250A-ZLH4;Black500GB;EA191M;SK-8115;M111s
2楼2014-01-23 16:05:21
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ERIC20081938

铁杆木虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by orangeleaf at 2014-01-23 16:05:21
觉得问题在第三步,条件或操作的原因。
3 PEG介导转化，质粒浓度大于10ug，用的是25%的PEG6000。

请问，能不能具体说明一下呢？我可以加你QQ号吗？
赞一下 回复此楼
Flytothesky```
3楼2014-01-24 10:02:07
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书枫2010

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

我敲除过T.reesei的基因
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4楼2014-02-18 17:33:06
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