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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求助做过3×Flag肽洗脱目的蛋白的大侠
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jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)

[求助] 求助做过3×Flag肽洗脱目的蛋白的大侠 已有1人参与

3×Flag肽不能洗脱带3×Flag标签的靶蛋白。
    Sigma的3×Flag肽，按说明用TBS溶解至5 mg/ml，分装冻存在-20℃。
    洗脱液的3×Flag浓度200 μg/ml，室温（约15℃）与珠子（蛋白G-Flag抗体-靶蛋白）孵育20 min，洗3 - 4次，基本不能洗脱珠子上的靶蛋白分别用过PBST、PBS、TBS，但只成功洗脱过一次，而且似乎跟这些缓冲液的选择无关。【可以确定珠子上有大量靶蛋白，基本使珠子满载】
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1楼 2014-01-11 17:51:04
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wufeifei2417

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
jurkat.1640: 金币+2, ★有帮助 2014-02-27 16:16:39
jurkat.1640: 金币+3 2014-04-14 15:40:27
我的一些小建议哈~

1.Sigma的3×Flag肽可以配成至25 mg/ml，这样可以保存的较久

2.洗脱时最好还是在2-8℃，30min以上，如果还不行可以加大次数、增大浓度、延长时间。

我也在做flag融合蛋白的纯化，也是洗不下来，用sds-page的loading buffer煮一下珠子WB信号倒是很强……

good luck
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2楼2014-02-27 16:10:26
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wufeifei2417

新虫 (初入文坛)
http://cshprotocols.cshlp.org/search?fulltext=flag&submit=yes&tocsectionid=protocol&tocsectionid=recipe&tocsectionid=topic+introduction&tocsectionid=emerging+model+organisms&tocsectionid=product+protocol&tocsectionid=kit&tocsectionid=information+panel&x=0&y=0

看看这个冷泉港的protocol吧
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3楼2014-02-27 16:39:27
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