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icenoreen铜虫 (初入文坛)
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[求助]
关于细胞迁移实验transwell使用的一些操作问题 已有3人参与
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我最近要做某种蛋白的趋化性试验，由于之前没有做过，所以在实验设计上查了不少资料，也参考了小木虫上的挺多经验，自己做了个实验设计，准备这两天做，但还有挺多细节不太明确，所以上来发一下我的实验步骤和设计，请教大家一些细节上的问题，也和做过的网友们交流一下。 我买的是Corning#3422 transwell，用的细胞是SD大白鼠的间充质干细胞。 根据查得的资料（包括transwell说明书，corning官网的指南，网上下的操作说明以及论坛上的交流总结）我把实验步骤简单总结如下： 1. MSC铺满培养瓶底80%左右时，换无血清培基，饥饿处理24h。【此处培基需要加0.5%BSA吗？】 2. 胰酶消化细胞，用无血清培基（含0.5%BSA）中止消化并稀释得细胞悬液（10万/ml）。 3. 100ul细胞悬液接种至上室，600ul 10%FBS的培基加入下室。【这个顺序对吗？还是应该先加下室？还是无所谓？】【干细胞的接种量多少比较合适？我这里是按照一般的24孔板用1万/孔可以吗？还有一般需要至少几个平行孔？transwell孔板比较贵，在保证尽量准确的情况下最少设2个平行样行吗？】 4. 孵育一定时间。【我的干细胞在培养瓶里时一般4小时左右就能贴壁，8小时基本完全铺展，那么做迁移测试的时候应该放多长时间呢？】 5. 计数。 (1) 用棉签擦去上室细胞。【这里我很不明确啊，我下载的官网说明只说“除去上室细胞”，网上网友大多都说用棉签擦掉，用的是一般的那种医用棉签？具体怎么擦？这样擦对下室细胞没影响么？】 (2) 染色用显微镜拍照和计数或MTT法测OD值计数。【是不是细胞比较多的时候测OD值更准确？如果我又想拍照又想测得比较准又不想设置太多孔平行样是不是可以用结晶紫染色后洗脱测一次OD值然后再次染色拍照？】 我的实验设计： 预实验：以不同接种数量和不同孵育时间试验找到最优条件。 实验：无血清培基（含0.5%BSA）中加入不同浓度待测蛋白作为下室培基进行实验，测该蛋白的dose-dependence，无血清培基（含0.5%BSA）作为空白对照，10%FBS培基作为正对照。 以上是我的实验设计，方括号里的是我的一些问题想请教大家......因为我还没开始做所以问题有点多......有做过或者准备做迁移实验的人一起来交流一下吧！ P.S. 我本身是材料专业做生物材料的，跨学科很多生物的东西都还在学，如果有的问题比较低级的话还请大家见谅和耐心赐教呢  [ Last edited by icenoreen on 2013-12-30 at 19:44 ] |
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 细胞科学 |
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自己顶上来，顺便再问一个问题…… 我做了一次迁移实验，用不同浓度百分比血清的培基来做的预实验，迁移细胞数量梯度倒是挺明显的，但染色以后显微镜下看发现细胞都在膜的边缘一圈，中间一个细胞也没有……不知道是为什么啊~ 我在想是不是我用棉签擦上层细胞的时候太用力所以把中间细胞都抖下去了？ 还是往上室加细胞悬液了以后细胞倾向于往边上贴壁？ 另外，谁能告诉我一下用棉签擦去上层细胞的具体细节啊？网上完全搜不到关于这个的详细说明，只有一句“用棉签擦”，大家都觉得很好擦吗？为什么我觉得很难擦啊，transwell上室就那么小，棉签头基本上刚好伸进去，很难确保整个都擦到了呀...... 求教擦上室细胞的具体方法！（用棉签或者用别的什么都可以，只要能除去上室细胞~） 再次不胜感激！ 回复的人好少好少...求交流呀>< |
4楼2014-01-02 20:26:38
