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gemini我在

新虫 (初入文坛)

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[交流] EMSA技术已有1人参与

从去年开始做EMSA，有成功的，有做不出来的，最近几次做的效果一直不好。。。
我用的是赛默飞的EMSA试剂盒，biotin探针试剂盒也是赛默飞的，抽核蛋白也是赛默飞的kit，最近做出来的都是只有引物带没有binding？？
1 我用的是4%的非变性凝胶
2 反应体系里面把试剂盒给出的optional的都加了
50%甘油 1ul
1%NP40 1ul
1M KCL    1ul
100mM Mgcl2 。。
200mM EDTA 。。
   dI.dC。。
   DTT  。。
10*binding buffer  2ul
biotin-DNA 2ul
核蛋白 5ug
20ul体系室温30min 电泳
3 电泳 100v 溴酚蓝到底
4 转膜 380mA 60min
剩下的操作都是和试剂盒中一样，但就是只有游离探针的带。。。

哪里会有问题呢？
ps这个探针以前用过，可以binding下来的

[ Last edited by silicare on 2014-2-26 at 16:32 ]

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1楼 2013-12-24 14:24:11

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妖精dan

新虫 (初入文坛)

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★
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我严格按照pierce的操作说明做的，只不过没有尼龙膜，用的PVDF膜。上了7个样，每个样是相同的蛋白，不同的探针，跑出来却是这样的。我实在不明白哪里出错了，今天又跑了一次，用的pierce的质控反应做阳性对照，结果质控也只有一个泳道有带，我自己的样品还是没有出带。求问各位高手，帮我分析原因。现在急死了，这个不做出来，后面的实验做不下去。。。（本人没有金币。。只能这样发布了）

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