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好好后生

金虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
想学好的学渣: 金币+5, ★★★很有帮助 2013-12-17 18:25:05
测序的时候没说明的话,一般都是只做上游引物测序的,末尾的都是不可信的,想要完整的要上下游都测,再互补了才行,你的同源性只有36%的话,明显不是你要的目的基因了,重新设计引物吧
11楼2013-12-16 13:48:22
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dongge2013

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
找下游引物干什么啊,有什么意义
12楼2013-12-16 15:36:01
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想学好的学渣

铁杆木虫 (正式写手)

引用回帖:
12楼: Originally posted by dongge2013 at 2013-12-16 15:36:01
找下游引物干什么啊,有什么意义

不一定非得要下游引物,只要同源率高也可以,我们实验室师姐跑出来的基本上都能找得到,我同源率低,可能是模板之类的出问题了,还在查找
13楼2013-12-17 18:26:37
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想学好的学渣

铁杆木虫 (正式写手)

引用回帖:
11楼: Originally posted by 好好后生 at 2013-12-16 13:48:22
测序的时候没说明的话,一般都是只做上游引物测序的,末尾的都是不可信的,想要完整的要上下游都测,再互补了才行,你的同源性只有36%的话,明显不是你要的目的基因了,重新设计引物吧

引物设计是不可能自己在设计好了,一条引物简并度是4,另一条是256,应该不算高撒,这是我设计了好久才搞定的,师兄设计的也是和我这个差不多
14楼2013-12-17 18:27:54
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想学好的学渣

铁杆木虫 (正式写手)

引用回帖:
10楼: Originally posted by lm2570 at 2013-12-15 13:42:46
你把下游引物反向互补后,再在所测序列中找一下,应该有了,如果没有,那你的序列可能沒测通

尝试了的,还是不行,应该不是我要的基因了
15楼2013-12-17 18:29:28
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想学好的学渣

铁杆木虫 (正式写手)

引用回帖:
9楼: Originally posted by 半生一梦 at 2013-12-15 13:38:35
下游引物要反向互补一下才能找得到的吧。。。。
感觉cDNA做普通PCR的话貌似可以放很久呢
要不连载体转化下感受态再去测序试试哎 那个还是很准的

反补了的,还是找不到,而且在ncbi上和26s同源率竟然达到98%最高,应该不是我要的了,出现了非特异性扩增,我也不晓得为啥子
16楼2013-12-17 18:30:39
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danio112

银虫 (小有名气)

如果测出来的序列与你的下游引物的距离很近,三十BP以内很正常的
17楼2013-12-17 20:50:12
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dongge2013

金虫 (小有名气)

引用回帖:
13楼: Originally posted by 想学好的学渣 at 2013-12-17 18:26:37
不一定非得要下游引物,只要同源率高也可以,我们实验室师姐跑出来的基本上都能找得到,我同源率低,可能是模板之类的出问题了,还在查找...

你用你的引物去UCSC做一下虚拟PCR,看看扩增的条带特异不,是不是你要的目的条带。
18楼2013-12-18 08:30:11
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半生一梦

木虫 (小有名气)

引用回帖:
16楼: Originally posted by 想学好的学渣 at 2013-12-17 18:30:39
反补了的,还是找不到,而且在ncbi上和26s同源率竟然达到98%最高,应该不是我要的了,出现了非特异性扩增,我也不晓得为啥子...

我以前也是自己设计简并引物去扩增 结果忙活了大半年都没扩增出来
就换课题了。。。。。加油啊!
19楼2013-12-18 11:37:33
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万万欢欢

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

测序是双脱氧终止来实现,ddNTP加过荧光信号,也就是说,经过ddNTP扩增的才能显示出来,你用来测序的那端引物是现成的,并没有加信号,所以测序的那头的引物是肯定找不到的,如果片段不长,建议可以用已经找到的那头再测过去,拼接应该就能找到两头引物了
20楼2014-01-11 10:31:35
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