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1095314666

金虫 (小有名气)
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10楼: Originally posted by love_糖糖 at 2013-12-17 11:17:03
谢谢您的建议。操作过程中，哪个因素影响最大呢？我以前不是学这个的，是不是有些关键地方让我忽略了呢？...

个人认为清洗和研磨比较大，你可以把你的详细操作过程说一下，我们共同探讨一下。
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路在脚下。
11楼2013-12-17 15:34:44
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love_糖糖

金虫 (正式写手)
引用回帖:
11楼: Originally posted by 1095314666 at 2013-12-17 15:34:44
个人认为清洗和研磨比较大，你可以把你的详细操作过程说一下，我们共同探讨一下。...

我是按照试剂盒的操作步骤来的，大体是这样：
1．取菌丝体放进研钵加入液氮充分碾磨。
2．将研磨好的粉末迅速转移到预先装有700 μl 65℃预热缓冲液GP1的离心管中（实验前巯基乙醇，使其终浓度为0.1%），迅速颠倒混匀65℃水浴20 min。
3．加入700 μl氯仿，充分混匀， 离心5 min。
4．将上层水相转入一个新的离心管中，加入700 μl缓冲液GP2，充分混
匀。
5．将混匀的液体转入吸附柱CB3中，离心30 sec，弃掉废液。
6．向吸附柱CB3中加入500 μl缓冲液GD离心30 sec，倒掉废液。
7．向吸附柱CB3中 加入600 μl 漂洗液PW离心30 sec，倒掉废液
8．重复操作步骤7.
9．将吸附柱CB3放回收集管中，离心2 min，倒掉废液。将吸附柱
CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
10.将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200 μl洗脱缓冲液TE，室温放置2-5 min，离心2 min，将溶液收集到离心管中。
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12楼2013-12-17 19:23:40
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Fleaves

至尊木虫 (著名写手)
看你这么苦逼，就不要用试剂盒了！用ctab提吧！

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13楼2013-12-17 19:50:51
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love_糖糖

金虫 (正式写手)
引用回帖:
13楼: Originally posted by Fleaves at 2013-12-17 19:50:51
看你这么苦逼，就不要用试剂盒了！用ctab提吧！

说的是呢！但是CTAB法具体操作步骤是什么呢？我查了下，各个说法不尽相同，不知道该用哪个。环顾了下实验室，貌似CTAB还要现买。。。
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14楼2013-12-17 22:50:49
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hmily8619

木虫 (正式写手)
这个试剂盒提取的量很少，跑胶是看不到的，直接提了做pcr完全可以

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幸福满满的……
15楼2013-12-17 23:08:17
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yuren2009

木虫 (正式写手)
我用的也是这个，研磨要充分，及时转移，另外，不要加太多菌丝粉末。

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学习使你立于不败之地
16楼2013-12-17 23:44:15
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love_糖糖

金虫 (正式写手)
引用回帖:
15楼: Originally posted by hmily8619 at 2013-12-17 23:08:17
这个试剂盒提取的量很少，跑胶是看不到的，直接提了做pcr完全可以

谢谢！我做过ＰＣＲ，那次是没Ｐ出来，但以后提完跑电泳没带就没再做ＰＣＲ，谢谢你的建议。我把提的都拿出来再做个ＰＣＲ试试。
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17楼2013-12-18 08:36:18
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love_糖糖

金虫 (正式写手)
引用回帖:
16楼: Originally posted by yuren2009 at 2013-12-17 23:44:15
我用的也是这个，研磨要充分，及时转移，另外，不要加太多菌丝粉末。

这几点都注意了，还是没效果，我在想我是不是可以多提几管，到后来都富集到一个吸附柱上，这样是不是浓度会高些？你看可不可行？
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18楼2013-12-18 08:38:29
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yuren2009

木虫 (正式写手)
引用回帖:
18楼: Originally posted by love_糖糖 at 2013-12-18 08:38:29
这几点都注意了，还是没效果，我在想我是不是可以多提几管，到后来都富集到一个吸附柱上，这样是不是浓度会高些？你看可不可行？...

把菌丝烘干，用干粉提取量，量会大点儿。有时候电泳看不到，但是PCR还是可以的。
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学习使你立于不败之地
19楼2013-12-18 10:06:21
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hmily8619

木虫 (正式写手)
引用回帖:
17楼: Originally posted by love_糖糖 at 2013-12-18 08:36:18
谢谢！我做过ＰＣＲ，那次是没Ｐ出来，但以后提完跑电泳没带就没再做ＰＣＲ，谢谢你的建议。我把提的都拿出来再做个ＰＣＲ试试。...

多提几管，到后来都富集到一个吸附柱上，25体系加1微升模板，或者你之前提的多加点模板，水少加点。循环多p几个

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幸福满满的……
20楼2013-12-18 12:29:01
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