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1095314666

金虫 (小有名气)

引用回帖:
10楼: Originally posted by love_糖糖 at 2013-12-17 11:17:03
谢谢您的建议。操作过程中,哪个因素影响最大呢?我以前不是学这个的,是不是有些关键地方让我忽略了呢?...

个人认为清洗和研磨比较大,你可以把你的详细操作过程说一下,我们共同探讨一下。
路在脚下。
11楼2013-12-17 15:34:44
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love_糖糖

金虫 (正式写手)

引用回帖:
11楼: Originally posted by 1095314666 at 2013-12-17 15:34:44
个人认为清洗和研磨比较大,你可以把你的详细操作过程说一下,我们共同探讨一下。...

我是按照试剂盒的操作步骤来的,大体是这样:
1.取菌丝体放进研钵加入液氮充分碾磨。
2.将研磨好的粉末迅速转移到预先装有700 μl 65℃预热缓冲液GP1的离心管中(实验前巯基乙醇,使其终浓度为0.1%),迅速颠倒混匀65℃水浴20 min。
3.加入700 μl氯仿,充分混匀, 离心5 min。
4.将上层水相转入一个新的离心管中,加入700 μl缓冲液GP2,充分混
匀。
5.将混匀的液体转入吸附柱CB3中,离心30 sec,弃掉废液。
6.向吸附柱CB3中加入500 μl缓冲液GD离心30 sec,倒掉废液。
7.向吸附柱CB3中 加入600 μl 漂洗液PW离心30 sec,倒掉废液
8.重复操作步骤7.
9.将吸附柱CB3放回收集管中,离心2 min,倒掉废液。将吸附柱
CB3置于室温放置数分钟,以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
10.将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中,向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200 μl洗脱缓冲液TE,室温放置2-5 min,离心2 min,将溶液收集到离心管中。
12楼2013-12-17 19:23:40
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Fleaves

至尊木虫 (著名写手)

看你这么苦逼,就不要用试剂盒了!用ctab提吧!

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13楼2013-12-17 19:50:51
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love_糖糖

金虫 (正式写手)

引用回帖:
13楼: Originally posted by Fleaves at 2013-12-17 19:50:51
看你这么苦逼,就不要用试剂盒了!用ctab提吧!

说的是呢!但是CTAB法具体操作步骤是什么呢?我查了下,各个说法不尽相同,不知道该用哪个。环顾了下实验室,貌似CTAB还要现买。。。
14楼2013-12-17 22:50:49
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hmily8619

木虫 (正式写手)

这个试剂盒提取的量很少,跑胶是看不到的,直接提了做pcr完全可以

[ 发自小木虫客户端 ]
幸福满满的……
15楼2013-12-17 23:08:17
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yuren2009

木虫 (正式写手)

我用的也是这个,研磨要充分,及时转移,另外,不要加太多菌丝粉末。

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学习使你立于不败之地
16楼2013-12-17 23:44:15
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love_糖糖

金虫 (正式写手)

引用回帖:
15楼: Originally posted by hmily8619 at 2013-12-17 23:08:17
这个试剂盒提取的量很少,跑胶是看不到的,直接提了做pcr完全可以

谢谢!我做过PCR,那次是没P出来,但以后提完跑电泳没带就没再做PCR,谢谢你的建议。我把提的都拿出来再做个PCR试试。
17楼2013-12-18 08:36:18
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love_糖糖

金虫 (正式写手)

引用回帖:
16楼: Originally posted by yuren2009 at 2013-12-17 23:44:15
我用的也是这个,研磨要充分,及时转移,另外,不要加太多菌丝粉末。

这几点都注意了,还是没效果,我在想我是不是可以多提几管,到后来都富集到一个吸附柱上,这样是不是浓度会高些?你看可不可行?
18楼2013-12-18 08:38:29
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yuren2009

木虫 (正式写手)

引用回帖:
18楼: Originally posted by love_糖糖 at 2013-12-18 08:38:29
这几点都注意了,还是没效果,我在想我是不是可以多提几管,到后来都富集到一个吸附柱上,这样是不是浓度会高些?你看可不可行?...

把菌丝烘干,用干粉提取量,量会大点儿。有时候电泳看不到,但是PCR还是可以的。
学习使你立于不败之地
19楼2013-12-18 10:06:21
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hmily8619

木虫 (正式写手)

引用回帖:
17楼: Originally posted by love_糖糖 at 2013-12-18 08:36:18
谢谢!我做过PCR,那次是没P出来,但以后提完跑电泳没带就没再做PCR,谢谢你的建议。我把提的都拿出来再做个PCR试试。...

多提几管,到后来都富集到一个吸附柱上,25体系加1微升模板,或者你之前提的多加点模板,水少加点。循环多p几个

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幸福满满的……
20楼2013-12-18 12:29:01
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