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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 为什么PCR跑出来是这样的
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laojiu9878

至尊木虫 (文坛精英)

九牛

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
琼脂糖凝胶凝的好不好，电压不要太高，电泳不要太长
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但愿人长久
11楼2013-12-13 09:32:39
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dingcong1216

新虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by hermain at 2013-12-12 21:40:17
你的marker用的是什么啊？最亮的那条是多大啊？你PCR目标产物大小是多少啊？假定最亮的一条是1kb的话，那么第一张图上排从左往右marker后的三个孔中的应该是PCR加入的引物。这样的话应该不是电泳的问题而是PCR的问题 ...

marker是takara的DL2000,最亮的那条是750，第一个图前6个目标产物是300左右，后3个是270多bp,中间是470多bp。前3个应该是引物二聚体，退火温度是3个梯度的，53,55,57,会再调整一下退火温度，可是marker也跑的不怎么好啊，是怎么回事
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12楼2013-12-13 09:44:43
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lihe131

至尊木虫 (文坛精英)
引用回帖:
7楼: Originally posted by dingcong1216 at 2013-12-13 09:25:20
用的TAE缓冲液，两边的marker 是takara的DL 2000,跑的是PCR产物...

胶浓度是不是大了点。
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13楼2013-12-13 10:19:43
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zyf20080825

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-12-13 14:47:47
一般95V，20-30min就行。在确保PCR没有问题的情况下，你的Marker都没跑好，应该是电泳时出了问题。我看你图中的胶好像是上下好几块，我建议你制单独的一块胶，单独跑看看。我以前出现过制上下都能点样的大胶，结果上面的没问题，下面的胶就出现弥散。还有就是把胶放在别人胶的后面跑，结果效果都很差。
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14楼2013-12-13 10:38:56
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zzl2516

金虫 (小有名气)
如果电压没问题 可以考虑换个buffer
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15楼2013-12-13 13:00:14
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hermain

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-12-13 14:48:04
引用回帖:
12楼: Originally posted by dingcong1216 at 2013-12-13 09:44:43
marker是takara的DL2000,最亮的那条是750，第一个图前6个目标产物是300左右，后3个是270多bp,中间是470多bp。前3个应该是引物二聚体，退火温度是3个梯度的，53,55,57,会再调整一下退火温度，可是marker也跑的不怎么 ...

marker的1000和750没有分开，你说用的是1.5的胶，我觉得有点大了。可以试着用1.2或1.0的胶。100V跑1h，用紫外灯看一下，如果还没分开的话，就再跑10min。还有，制胶的时候梳子一定要洗干净。
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16楼2013-12-13 13:51:00
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hermain

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-12-13 14:47:58
marker的1000和750没有分开，你说用的是1.5的胶，我觉得有点大了。可以试着用1.2或1.0的胶。100V跑1h，用紫外灯看一下，如果还没分开的话，就再跑10min。还有，制胶的时候梳子一定要洗干净。
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17楼2013-12-13 14:24:39
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
关于跑胶可以参看这个帖子4楼解答：
http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=6669314&fpage=1
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学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
18楼2013-12-13 14:51:03
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昙花巫婆

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-12-28 21:07:46
你跑的时间太长了，通常小片段的带，跑十分钟就可以看了，大片段的带跑20分钟可以看了，跑的时间长了，就弥散了，就会出现你这种情况
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我是女博士，但我并不可怕！
19楼2013-12-13 21:46:38
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zijinok

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-12-28 21:07:52
你的Marker跑出来就怪怪的，感觉是配胶的问题，Agarose没有溶解充分，还以透明的颗粒状存在，就会导致跑的条带弯弯曲曲，且呈现弥散状。
建议你配胶的时候，加热一会就充分混匀，最好在灯光下看到没有透明颗粒了再配胶。
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20楼2013-12-28 15:06:13
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