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【分享】关于RNA的PCR扩增【已搜索无重复】
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RT-PCR技术 分离纯净、完整的RNA对于分子克隆的实验是很重要的，而且是进行基因表达分析的基础。 在所有RNA实验中，最关键的因素是分离得到全长的RNA。 分离RNA的一个主要用途是分析基因的表达，常用方法：S1核酸酶分析、核糖核酸酶保护实验、引物延伸法、Northern印迹分析及nuclear run-off转录分析技术。 注意： 1. RNA酶的污染。RNA酶很稳定，一般而言反应不需辅助因子。为避免RNA酶的污染，实验中所用到的全部溶液、玻璃器皿和塑料制品都需特别处理。 2. 焦碳酸二乙酯(DEPC)处理可使RNA酶失活，但是DEPC会与Tris发生化学反应而失效。 DEPC有致癌之嫌，须小心操作。 一、 RNA提取 提取RNA 的方法主要有稀碱法、浓盐法、苯酚法、异硫氰酸胍Cscl 超速离心法、盐酸胍-有机溶济法、Licl-尿素法与异硫氰胍法等。 使用Trizol一步法来提取细胞中的RNA。 1. 收取细胞，用1×PBS洗2次。 2. 加入Trizol 1ml，混匀，室温放置5min。 3. 加入氯仿0.2ml，混匀，置于室温2～3min。 4. 离心4℃，12000转/min，15min。 5. 取上清液，加异丙醇0.5ml，室温放置10min。 6. 离心4℃，12000转/min，10min。 7. 弃上清液并轻轻吸干，加75%乙醇1ml，混匀。 8. 离心4℃，7500转/min，5min。 9. 弃上清，倒置于干净滤纸上片刻；离心5000转/min，3min。 10. 移去乙醇，置于通风橱内至乙醇完全挥发。 11. 加入DEPC水，混匀。 注意事项： 1. 75%乙醇用DEPC配置，-20℃预冷。 2. 混匀的手法要轻柔。 3. 在取上清液时要小心，不要扰动管内液体，尤其小心不要吸取到分层面以下液体，最好是距分层面还有一定距离，以保证所提取RNA的质量。 4. 加入DEPC的量依据RNA的量而定。 5. 整个操作过程在冰上。 二、 RNA浓度测定 1. 方法与DNA浓度测定相同。 2. 注意RNA的A260/A280=1.8~2.0。 3. 将RNA统一稀释为1μg/μl ，于-20℃保存备用。 另：所提取的RNA在凝胶电泳时至少可以看到两条带(28srRNA和18srRNA)，且两条带宽比为2:1。 三、 RT方法 1. 取RNA 2μg + 10μM oligidT(36)AGC 3μl + ddH2O 9μl，混匀。（总体积为14μl） 2. 70℃，4min。 3. 迅速置于冰上3min。 4. 向混合物中加入5×R-T缓冲液6μl + 5mM dNTPs 1μl + 反转录酶(M-MLV)0.5μl + ddH2O 8.5μl，混匀。（总体积为30μl） 5. 42℃，90min。 6. 70℃，5min灭活反转录酶。 四、 PCR条件 与其他PCR条件相同。即：95℃预变性5min；接着进入循环，首先95℃变性30s，然后退火温度复性30s，接着72℃延伸40s，循环后72℃延伸10min。 注：模板为RT的产物。 反应体系可适当增大。 退火温度可能有所不同 落PCR主要用于提高PCR的特异性.剃度PCR用于选择PCR体系的最适退火温度. 降落PCR（TouchDown PCR） 在一个反应管中, 通过在PCR 的前几个循环使用严紧的退火条件提高特异性。循环设在比估算,的Tm 高大约5℃的退火温度下开始，然后每个循环降低1℃到2℃（当然，也可以每几个循环降1－2℃），直到退火温度低于Tm 5℃。特异性最高的目的模板会被优先扩增，这些产物在随后的循环中继续扩增占据优势。递减PCR 对于那些不了解引物和目的模板同源性程度的方法更为有用. 剃度PCR 采用多个PCR管进行反应,每管的退火温度不一样.在常用的PCR仪上可以自己设定最高退火温度/,最低退火温度,然后设定每个剃度的间隔值. 降落pcr（touchdown pcr），一种pcr技术。 设计多循环反应的程序，以使相连循环的退火温度越来越低。由于开始时的退火温度选择为高于估计的tm值，随着循环的进行，退火温度逐渐降到tm值，并最终低于这个水平，用于确保第一个引物—模板杂交事件发生在最互补的反应物之间，即那些产生目的扩增产物的反应物之间。尽管退火温度最终会降到非特异杂交的tm值，但此时目的扩增产物已开始几何扩增，在剩下的循环中处于超过任何滞后（非特异）pcr产物的地位。 由于目标是在较早的循环中避免低tm值配对，在td—pcr中最好应用热启动技术。设计时，退火温度的范围应跨越15℃左右，从高于估计tm值至少几度到低于它10℃。 例：一对没有简并的引物—模板的计算tm值为62℃。 则：从65℃—>50℃（每2cycles降退火温度1℃），再在50℃退火温度下做15个循环。 实验中如持续出现假象带（杂带），则是因为起始退火温度太低，或目的扩增产物和非目的产物的tm值相差无几，或非目的扩增物以更高的扩增效率扩增，可把退火温度每降低1℃所需的循环数增加到3或4。 [search]RNA PCR[/search] |
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