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cherish-木金虫 (小有名气)
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求果蔬中C4H，4CL 酶的测定方法或相关文献 已有1人参与
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想要测定杏子中的C4H（肉桂酸羟化酶）、4CL（4-香豆酰-辅酶A 连接酶）,CHS（查尔酮合成酶），苦于没有准确测定方法 ，望各位前辈有做过相关实验的能不吝赐教，或者能给予相关外文文献全文（中文文献中的方法看过了但是不具体），谢谢各位了。 |
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50mM Tris-Hcl的配方网上都有，你可以搜一下，其他的巯基乙醇 105uL（这个就是买的原液），Vc 0.044025g, 6水氯化镁 0.0813g, 亮肽素（我直接在管里加1 ml Tris-hcl, 短期用完的话放4度，长期的话可以分装一下放-20）237.8uL，PVP 0.15g, 甘油10ml, 最后用Tris-hcl定容到100ml，因为亮肽素在4度环境能放一周吧，所以配好之后尽快测。4cl的也差不多 |
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cherish-木9楼2013-12-24 11:28:37
【答案】应助回帖
★ ★ ★
cherish-木: 金币+3, ★★★很有帮助 2013-12-18 16:45:11
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我只测C4H 4CL，参照-美洲南瓜(Cucurbitapepo)种皮发育形态观察 及其相关酶活性测定，葡萄酒中酚酸及葡萄果实苯丙烷类代谢途径研究，听过这方面论文的，我测得菊花花瓣 C4H 参照Lamb 和Rubery等的方法。液氮研磨材料0.1g，加入10ml提取液（50 mmol/L Tris-HCl：pH8.9，15mmol/L β-巯基乙醇，4 mmol/L MgCl2，5mmol/L Vc，10μmol/L Leupeptin 亮肽素，1 mmol/L PMSF，0.15%: w/v PVP，10%甘油，混匀后超声波破碎2 min，四层纱布过滤后，在4℃下以12000r./min 离心20min .取上清液为C4H粗酶提取液。酶反应液组成为：0.8ml 酶提取液，2.2ml缓冲液（2μmol/L 反式肉桂酸，50 mmol/L Tris-HCl: pH8.9，2μmol/L NADPNa2，5μmol/L G-6-PNa2）。25℃下振荡30分钟后，100r/min，加入100μL 6mol/L HCl终止反应，以12000r./min 离心10min，取上清液在340 nm处比色。参比为不加酶提取液（加入0.8 mL ddH2O）。OD值每1h变化0.01为一个酶活性单位，酶活性表示为：U/mg.prot.h 4CL 按照Knobloch和Halllbrock(1975)的方法。液氮研磨材料0.1g，加入10ml提取液(50mMTris-HCI: pH8.9，15mM β-疏基乙醇，5mM EDTA， 5mM Vc，10mM Leupeptin，lmM PMSF，0.15%: m/V PVP，10%甘油)，混匀后超声波破碎2min，四层纱布过滤后，在4℃下以12000r./min 离心20min，取上清液即为4CL粗酶提取液。反应液体积为3mL，其中含酶液0.4mL，3ml(5µM对香豆酸，50µM ATP，1µM CoA-SH，15µM MgSO4•7H2O)， 40℃下反应10min后，在333nm处测定OD值，参比为不加酶提取液。OD值每1h变化0.0001为一个酶活性单位，酶活性表示为:U/mg.prot.h。 |
6楼2013-12-18 10:27:22
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