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daimingdao

新虫 (初入文坛)

[求助] RedE/T转染大肠菌 已有1人参与

看帖的客官好。
我在大肠菌中导入pRedE/T之后想重组BAC。hm之间的序列原来是330bp,重组后应该含有的外源序列(rpsl-neo)是1300左右。电转后用含有kanamycin的板子删选,挑取单菌落制作master plate并进行colony PCR。master plate也长得很好,可是P出来的结果却含有330和1300两条带。请问这是什么原因呢?不是应该重组之后就只有1300一条带么?
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huahu3600

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流! 2013-11-22 16:50:20
这个需要多转化几次,330就没有了
或者,找个酶线性化一下,再连接,转化一下。挑取克隆鉴定一下,99%的情况下,330消除。

你得排除掉污染,菌液或菌落PCR最怕污染。
2楼2013-11-22 16:34:22
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小尾巴亚杰

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

你后面用不用把rpsl去掉呢?用不用再去掉neo这个抗性?
3楼2014-04-21 13:07:41
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