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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 慢病毒制备 制备的病毒滴度很低很低。。。。
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kinda_

铁虫 (小有名气)

[求助] 慢病毒制备 制备的病毒滴度很低很低。。。。

本人构建了带GFP标记的shRNA载体，用四质粒系统。之前做的是，每次转染的时候，293T细胞都是满满的全是荧光，但是收集了病毒之后按1:100或者1:1000稀释再转293T细胞，就没什么荧光了。后来考虑293T细胞株可能有问题，然后就换了一株293T，结果还是一样。。
我的操作步骤是这样的：
病毒制备用的是293T细胞，传代<20代，（设置不加ViraPower mix的对照，对照样品加1.8ul Lip2000）。按照公司的说明书进行病毒制备，具体做法如下。
1：a，1.5mL EP管，1.8ug ViraPower mix，0.6ug 质粒 于300ul Opti-MEM培养基中，无血清，轻轻混匀。
      b，1.5mL EP管，7.2ul Lip2000于300ul Opti-MEM培养基中，无血清，轻轻混匀。
      c，a与b混合，颠倒混匀，室温静置20min。
2: 293T细胞，1.2X106/ml于完全培养基，无抗生素。
3: 往六孔板中预先加入1ml无抗生素的完全培养基。
4: 将DNA-Lip2000复合物加至六孔板。
5：加入1ml293T细胞。轻轻晃匀，37度，5%CO2培养箱培养。
6: 转染6h后换无抗生素的完全培养基，去除Lip2000
7：转染24h之后换含有丙酮酸钠 无抗生素的完全培养基
8：转染48h后观察荧光，收集病毒。重新加入含有丙酮酸钠 无抗生素的完全培养基。
9：转染72h后观察荧光，收集病毒。
病毒收集的过程：取上清至10mlEP 管，2000g 4度离心 10min，取上清液，-70保存。
1:297T细胞铺于6孔板，37度，5%CO2培养箱培养过夜。
2：次日，弃去细胞上清，取收集的病毒，用完全培养基（无抗生素）稀释至10-2，加至293T细胞。混匀后每孔补加1ul polybrene（6mg/ml），继续培养。
3：24h后换完全培养基，观察荧光。
4: 48h后观察荧光。
结果发现，加ViraPower mix见附件图1，不加ViraPower mix见附件图2.可见，加ViraPower mix的转染效率明显高于对照组。
但是用加ViraPower mix组的制备的病毒继续侵染293T细胞，发现很少有荧光（图3）

图1 GFP标签载体的慢病毒制备（293T细胞）

图2 GFP标签载体的直接转染结果（293T细胞）

图3        GFP标签载体的慢病毒侵染结果（293T细胞）

请教各位这到底是哪里出了问题了？
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1楼2013-11-20 18:49:15
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gyesang

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【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kinda_: 金币+20, ★★★很有帮助, 谢谢 2013-11-24 11:08:05
你的病毒上清1：100的加到细胞里面吗？我们都是1：1的感染，也就是如果是6孔板，1ml病毒上清+1ml新鲜培养基，你的病毒上清是不是加太少了呢
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kinda_
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2楼2013-11-21 01:34:51
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kinda_

铁虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by gyesang at 2013-11-21 01:34:51
你的病毒上清1：100的加到细胞里面吗？我们都是1：1的感染，也就是如果是6孔板，1ml病毒上清+1ml新鲜培养基，你的病毒上清是不是加太少了呢

我今天试一下1:1看看
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3楼2013-11-21 09:13:12
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lhs521521

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

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感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-11-21 12:34:52
kinda_: 金币+15, ★★★很有帮助, 谢谢 2013-11-24 11:07:53
你之前的离心也是2000g吗？是不是太低了，我们在收集上清后，要加病毒浓缩液，4度24h，之后5000g，30min，4°；或者是超速离心，25000rpm，2h！仅供参考！
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kinda_
寻找真正的自我！
4楼2013-11-21 09:15:02
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kinda_

铁虫 (小有名气)
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引用回帖:
4楼: Originally posted by lhs521521 at 2013-11-21 09:15:02
你之前的离心也是2000g吗？是不是太低了，我们在收集上清后，要加病毒浓缩液，4度24h，之后5000g，30min，4°；或者是超速离心，25000rpm，2h！仅供参考！

我们2000g离心是去细胞碎片，然后取上清。你们加浓缩液或者超高速离心是取沉淀？能不能说具体一点呢？这样做了之后，病毒侵染是时候是几比几稀释？谢谢
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5楼2013-11-21 12:40:03
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lhs521521

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

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kinda_: 金币+15, ★★★很有帮助, 谢谢 2013-11-24 11:07:37
gyesang: 金币+3, 鼓励交流！ 2013-11-24 15:43:52
引用回帖:
5楼: Originally posted by kinda_ at 2013-11-21 12:40:03
我们2000g离心是去细胞碎片，然后取上清。你们加浓缩液或者超高速离心是取沉淀？能不能说具体一点呢？这样做了之后，病毒侵染是时候是几比几稀释？谢谢...

我们的方法是2000g离心，去碎片，0.45滤膜过滤；加病毒浓缩液，4°放置24h；5000g，30min，4°；或者是超速离心，25000rpm，2h！去上清，留沉淀；用无血清培养基溶解（10cm皿，加600ul）；侵染293T只需很少，大概50ul-100ul就差不多；感染其他细胞，全部加入进去。仅供参考！好运！
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寻找真正的自我！
6楼2013-11-22 14:52:01
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kinda_

铁虫 (小有名气)
我加原液和培养基1：1试了下，效果还不错，不知道感染目的细胞会怎么样，打算用超滤管浓缩一下。不知道有没有人用过超滤管的？那个要重复使用的话怎么处理？本人是新手，对于后续的试验，欢迎再提建议！谢谢各位！
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7楼2013-11-24 11:10:51
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gyesang

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引用回帖:
7楼: Originally posted by kinda_ at 2013-11-24 11:10:51
我加原液和培养基1：1试了下，效果还不错，不知道感染目的细胞会怎么样，打算用超滤管浓缩一下。不知道有没有人用过超滤管的？那个要重复使用的话怎么处理？本人是新手，对于后续的试验，欢迎再提建议！谢谢各位！

还是超速离心比较好，包两个10cm的dish，收48h和72小时的上清大概有36ml的病毒上清，然后离心，沉淀用无血清DMEM重悬，大概300ul，感染6cm dish的细胞用30ul够了
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8楼2013-11-24 15:46:00
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