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小二丫结婚金虫 (初入文坛)
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[求助]
大肠杆菌基因工程菌表达的L-门冬酰胺酶纯化及酶活测定方法，求指点！已有1人参与
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| 本人构建了一株大肠杆菌基因工程菌，诱导后用于发酵产L-门冬酰胺酶（原设计是胞外表达），我是直接将发酵液挂Ni柱子纯化蛋白（有组氨酸标签），用诱导前发酵液、诱导后发酵液、纯化的目的蛋白同时跑电泳，结果没看到目的蛋白分子量大小的条带。还有，将发酵液离心后的上清液和菌体洗涤后悬浮再破壁的溶液同时测酶活（奈斯勒试剂显色法：1ml0.04M的天冬酰胺底物加1ml0.02MpH=8的磷酸盐缓冲液，37度水浴5min预热后，加入粗酶液500ul37度反应15min后，加入1ml50%的三氯乙酸终止反应。再从终止管里取500ul加到3.5ml蒸馏水中，加入1ml奈斯勒试剂显色15min，500nm处测OD值），结果值很低；在测OD值之前我将浑浊的反应液都离心过了，加入奈斯勒试剂后明明看到颜色变得深黄，然后测OD值时却显示很低，实在不知道原因。请各位高手给点建议~~~谢谢 |
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