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新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

应该是模板浓度太低了
11楼2013-12-16 19:40:43
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漩涡鸣人

新虫 (初入文坛)

请问楼主最后怎么解决的?
12楼2014-01-06 21:39:41
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2009wqg

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

如果你是做的单通道检测项目,那这个问题一般很好解决:
1、建议做完40个循环。
2、如果40个循环后曲线还是不呈“S”型,建议按荧光PCR通用体系自配试下(网上随便搜个荧光PCR通用体系,dNTP/buffer/Mg离子/酶都可以先采用TAKARA的试下,体系优化没有想象的那么重要)
3、如果以上2者还不行,往往只不过是表明你采用的引物探针效果不好,需要重新设计序列。(探针比较贵,轻易不换,建议你先多设计几对引物序列,然后再按通用体系扩下,对了模板就用质粒就行了——不清楚质粒用多大浓度,则把小量提取的质粒从原液做10倍、100倍、1000倍、10000倍、100000倍稀释就行了)实在换引物不行,再考虑重新设计探针和引物(甚至换扩增区间)。
13楼2014-04-29 15:29:53
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gengkan

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

主要还是循环数不够造成的吧,我们一般要做到45个呢
14楼2015-04-24 10:31:25
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WHABnew

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

我做定量也用的这台型号,但是方法可能不一样,首先看你的基因是不是本来表达丰度就很低,另外就是你的模板浓度,还有就是按照你用的试剂盒建议的循环数,希望对楼主有用。
15楼2015-04-24 14:04:53
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wx26794

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

曲线没有指数期,直接进入线性期,PCR扩增效率较差,可能跟模板质量、酶的活性有关。
16楼2015-06-01 17:04:26
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