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不离不弃1215

铜虫 (小有名气)

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[求助] 荧光定量PCR扩增曲线怎么成这样了呢？为什么? 已有5人参与

各位大神，帮帮忙呀！小妹我是荧光定量PCR的初学者，实验室有没有一个人做过荧光定量PCR 实验，现在老师把这个新东西给我了，要我建立这个体系，一切靠自己，慢慢的摸出点门道了，可是现在却出现这个问题，真的是纠结了两个月了还是没办法，现在你们是我最后的希望了。别的不多说了，大家看图吧，我用的仪器是ABIA的STEP ONE ，探针法做，结果发现曲线没有对数期，直接的一条线性曲线就出来了，而且看不到平台期，这是为什么呀？天呐，我都快被这个折磨疯了

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1楼 2013-11-17 20:12:11

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2009wqg

新虫 (小有名气)

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【答案】应助回帖

如果你是做的单通道检测项目，那这个问题一般很好解决：
1、建议做完40个循环。
2、如果40个循环后曲线还是不呈“S”型，建议按荧光PCR通用体系自配试下（网上随便搜个荧光PCR通用体系，dNTP/buffer/Mg离子/酶都可以先采用TAKARA的试下，体系优化没有想象的那么重要）
3、如果以上2者还不行，往往只不过是表明你采用的引物探针效果不好，需要重新设计序列。（探针比较贵，轻易不换，建议你先多设计几对引物序列，然后再按通用体系扩下，对了模板就用质粒就行了——不清楚质粒用多大浓度，则把小量提取的质粒从原液做10倍、100倍、1000倍、10000倍、100000倍稀释就行了）实在换引物不行，再考虑重新设计探针和引物（甚至换扩增区间）。