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susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖甜到憂傷

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[交流] 什么是SD培养基？配置方法，筛选原理。我整理下了，免得大家老是来问了。已有10人参与

好久没来生物板块了，主要是工作的原因，基本很少做生物方面的东西了，
最近偶尔来转转，来看看自己越来越陌生的专业，兴趣爱好，仿佛在生活面前变得如此苍白，
不牢骚了，最近看板块不少人问起SD培养基，以及其筛选的原理，好像以前也有不少人问，回答多次，今天根据自己的一点了解，通过实际的例子来简单介绍下SD培养基的配置及筛选原理。（养酵母是5年前了啊，也就养了半年的样子，不知道还记得不）
=============================================================
（1）SD培养基：（Synthetic Dropout Medium）

用于酵母繁殖和筛选的培养基
SD是含有盐类、微量元素、维生素、氮源(不含氨基酸的酵母氮碱)和葡萄糖的合成基本培养基。

注意：氮源(不含氨基酸的酵母氮碱)是这种培养基用于筛选的关键，LB，YPD这种复合培养基因为用到了酵母提取物，蛋白胨，基本是氮源全营养的，肯定是不能用来做氮源筛选的=============================================================
（2）SD培养基配方及配置方法：
注意，配置SD培养基必须先要知道你所用到的宿主酵母的基因型，至少要知道你用的酵母菌有哪些氨基酸缺陷。以我唯一接触过的酿酒酵母为例
BY4741 [genotype, Mata his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0])
以前经常有人问，这些字符时很么意思？其实很简单，也就是这个酵母菌是His，Leu，Met这三种氨基酸以及Ura缺陷型。至于后面数字，分别表示表达这些氨基酸的基因的几个拷贝数缺失到剩余几个拷贝的意思，例如his3Δ1 3个缺失到剩余一个，以此类推，虽然His不像后面的Leu，Met，Ura全部缺失了，但是在没有添加组氨酸的SD中还是不能够生长的。（表述也许不完全科学，但也就是这么个意思）

总之，这个宿主菌有4个筛选标记了，分别为His，Leu，Met，Ura

那SD培养基是如何配置呢？配置方法如下：（可以参考毕赤酵母操作手册配方）
SD培养基：（Synthetic Dropout Medium）
6.7 % YNB 2%葡萄糖
1 灭菌 850 ml 水
2 于 60 度下加入 50 ml  10×YNB，100 ml 10×D
3 添加氨基酸时，加入 10 ml 100×AA，混匀存于 4 度
4 如制备平板，于第一步加入 20 g 琼脂粉
5 倒置平板，4 度放置几个月
*100×AA
溶解 0.2 g组氨酸(Histidine) ， 1.0 g亮氨酸(Leudne) ，0.2 g甲硫氨酸(Methionine) ，0.2 g尿嘧啶(Uracil) 于100 ml的水中，过滤除菌，存于 4 度，可放 1 年
*10×YNB（13.4%酵母氮源碱（YNB）含硫酸铵不含氨基酸）
溶解134 gYNB 于1000 ml水中，过滤除菌，加热至 YNB 完全溶解，存于 4 度。或者用34 gYNB（不含硫酸铵不含氨基酸），100 g  硫酸铵进行配制，可放 1 年。

注意：我这个培养是针对我的宿主菌BY4741来配置的，各种SD培养基配方都一样，唯一的是*100×AA 溶剂配置的方法不一样。你的宿主菌是什么类型的基因型，有哪些氨基酸缺陷（或者嘧啶缺陷），你就添加什么样的氨基酸。我的宿主菌是His，Leu，Met，Ura缺陷，因此我就添加这几种氨基酸。

各类氨基酸添加浓度见下表（溶解在1 L水中即为*100×AA）
腺嘌呤(Adenine) 0.5g
丙氨酸(Alanine) 2.0g
精氨酸(ArSinine) 2.0g
天冬酰胺(Asparagine) 2.0g
天冬氨酸(AsPanic acid) 2.0g
半胱氨酸(Cysteine) 2.0g
谷氨酰胺(Glatamine) 2.0g
谷氨酸(Glutsmic acid) 2.0g
甘氨酸(GIycine) 2.0g
组氨组(Histidine) 2.0g
肌醇(Inositol) 2.0g
异亮氨酸(Isoleucine) 2.0g
亮氨酸(Leudne) 10.0g
赖氨酸(Lysine)       2.0g
甲硫氨酸(Methionine) 2.0g
对氨基苯甲酸(para-Aminobenzoic acid)  0.2g
苯丙氨酸(Phenylalanine) 2.0g
脯氨酸(Proline) 2.0g
丝氨酸(Serine) 2.0g
苏氨酸(Threonine) 2.0g
色氨酸(Tryptophan) 2.0g
酪氨酸(Tyrosine) 2.0g
尿嘧啶(Uracil) 2.0g
缬氨酸(Valine) 2.0g
摘录于Adams等人(1998)的资料。
=====================================================================
（3）SD培养基的筛选原理：
上面讲到了SD培养基的配置原理及方法，那SD培养基又是怎么样用来筛选的呢？全营养的SD培养基配置要知道宿主菌的基因型，那么筛选用的SD培养基的配置就需要和你质粒筛选标记或者你整合的基因片段的筛选标记来定了，如下图，两个经典酿酒酵母质粒：
pDR195，负载型，这属性，口水直流啊，辗转拿到它，已经被人改造了好几次，我拿去测了序，所以它的每个碱基至今还在在我的vector里，一览无遗啊，可惜我已经将质粒实物遗留在以前的实验室了，后来的人，也不会知道它的来之不易，早就清理掉了吧。

第二个质粒，pδ-UB，出名哦Ro, D.-K., E. M. Paradise, et al. (2006). "☆Production of the antimalarial drug precursor artemisinic acid in engineered yeast." Nature 。提到合成生物学，没有不提Keasling 和他的青蒿素，这哥们就用到这个质粒做整合。好吧，我承认我曾经很想拥有它，但那只是个念想，和课题一起破灭了。

这两个质粒无论是负载型的还是整合型的，筛选标记都是URA，因此配置筛选培养基SD-Ura（Synthetic Dropout Medium－Uracil）：不加尿嘧啶。因为如果是阳性克隆的话，那么尿嘧啶缺陷可以通过质粒上的URA基因进行了补充。怎么样？是不是和原核表达中，阳性筛选很相像啊，其实本来就很简单，原理也都是相通的。

题外话：（1）作为宿主菌有几个氨基酸缺陷型，一方面单基因表达时它有多种质粒的选择，另一方面多基因表达时，可多质粒共表达。
（2）pδ-UB这个质粒太牛了，双酶切后得到的整合片段整合进酵母基因组组氨酸hisG位置，立刻就产生了另外两个hisG整合位点，如果再整合进一个拷贝，整合位点就增加到三个，真是“一生二，二生三，三生万物”啊，所以这就导致很容易获得基因的多拷贝整合的（好吧，和毕赤酵母整合型质粒很像）。另外在特殊培养条件下，尿嘧啶筛选标记还能脱落啊，这就太欺负人了，万能整合啊，所以Keasling做青蒿素（准确来说是其前体）时，就用这么个质粒，整合了n个基因。

pDR.JPG

pδ-UB.JPG

SD培养基：（Synthetic Dropout Medium）
6.7 ‰ YNB 2%葡萄糖

[ Last edited by susizheng on 2014-3-27 at 17:25 ]

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Thank-you，so-blue.

1楼 2013-11-14 16:01:28

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引用回帖:

6楼: Originally posted by 十口心思 at 2014-02-11 10:08:20
非常感谢。这些启动子的商业化质粒吗？我现在想设计一个实验，两种基因在酿酒酵母中分别可控表达。一个确定了用GAL1启动子，并且有现成质粒pYD1。另一个现在还找不到合适质粒。我想这个质粒是定点整合型的，使酵母 ...

应该可以实现，酿酒酵母质粒挺多的。可以在各大试剂公司网站上看看，应该也不贵。