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彭艳prene

新虫 (初入文坛)

应助: 0 (幼儿园)
金币: 57.5
帖子: 21
在线: 6.4小时
虫号: 1243427
注册: 2011-03-24
专业: 临床药理

[求助] 载体构建

本人做载体构建快半年了，载体是pcDNA3.1（-），大小5k左右，目的片段大小2.7k，我分为两段连，先将两段连到T载体上，测序验证没有问题，然后酶切，分别连到目的载体上，一段已经连上去了经酶切没有问题，但是另一段就是连不上去，卡在最后一步很久，跪求各位高人有类似经验的指导指导，小妮子不胜感激

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1楼 2013-10-28 21:32:37

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zhouxiaofei

银虫 (小有名气)

应助: 11 (小学生)
金币: 369
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在线: 113.5小时
虫号: 1807658
注册: 2012-05-10
性别: GG
专业: 免疫生物学

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-10-31 13:08:41

如果片段测序没有问题，连接最主要是载体和片段的摩尔比，在1:1-3之间比较好，建议你胶回收后，再走个电泳根据亮度判断怎么加比例，我用fermentas的连接酶，一般30min中就ok了，3.1插入过4k片段也ok。

还有需要注意一点，你做酶切的时候有些酶是有星活性的，需要注意下酶切时间，保证酶切正确。

其实不用分析太多原因，严格每步都质控好，重复一次就ok了！希望有帮助。