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彭艳prene

新虫 (初入文坛)

[求助] 载体构建

本人做载体构建快半年了,载体是pcDNA3.1(-),大小5k左右,目的片段大小2.7k,我分为两段连,先将两段连到T载体上,测序验证没有问题,然后酶切,分别连到目的载体上,一段已经连上去了经酶切没有问题,但是另一段就是连不上去,卡在最后一步很久,跪求各位高人有类似经验的指导指导,小妮子不胜感激
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zhouxiaofei

银虫 (小有名气)

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gyesang: 金币+2, 鼓励交流! 2013-10-31 13:08:41
如果片段测序没有问题,连接最主要是载体和片段的摩尔比,在1:1-3之间比较好,建议你胶回收后,再走个电泳根据亮度判断怎么加比例,我用fermentas的连接酶,一般30min中就ok了,3.1插入过4k片段也ok。

还有需要注意一点,你做酶切的时候有些酶是有星活性的,需要注意下酶切时间,保证酶切正确。

其实不用分析太多原因,严格每步都质控好,重复一次就ok了!希望有帮助。
11楼2013-10-31 10:29:08
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wilzu

木虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
gyesang: 金币+1, 鼓励交流! 2013-10-29 01:11:57
是双酶分步克隆到pcdna3.1的mcs ,两个片段两端都有设计酶切位点?

[ 发自小木虫客户端 ]
2楼2013-10-28 23:35:19
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kehan777

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
gyesang: 金币+1, 鼓励交流! 2013-10-29 01:12:30
酶切后有没有电泳鉴定一下结果,如果胶回收的话,回收率又是多少?你的连接体系有没有问题?还有难连接的话,连接时间可以延长一些
3楼2013-10-28 23:39:44
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wuyao0513

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流! 2013-10-29 16:36:51
你可以先在T载体上构建好含有两个片段,最后再转到目的载体上!
4楼2013-10-29 11:51:47
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