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Rubisco580

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

16.5KD容易跑过,要小心。
看看一抗行不行。
再有就是,二抗用对了吗,种属别搞错
11楼2014-04-25 15:33:55
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

一、Western Blot实验条带没出现的原因分析及解决办法 :
        原因分析                                                                        解决办法         
1.一抗和二抗失效                                                        1.  更换抗体;选择现用现配的工作液
2.一抗和二抗不匹配                                                     2. 更换为同种同属的同亚型的抗体底物
3.发光液失效                                                              3. 更换新的发光液
4.抗体染色不充分                                                        4. 增加抗体浓度;延长孵育时间
5.被测样品中不含有目的蛋白质或者目的 蛋白质含量太低    5. 设置阳性对照。确定标本中是否含有目的蛋白质;
                                                                                    增加样品 的上样量。
6. 溶液中有辣根过氧化物酶的抑制剂                         6.用透析和超滤除去所用溶液中如叠氮化钠之类的抑制剂
7.抗体活力降低                                                     7.在抗体活力保存时间内使用抗体;工作液现用现配
二、一抗与二抗的专一性识别检测,就是蛋白质-蛋白质相互作用检测,方法很多,免疫共沉淀、Pull down、MADLI-MS、能量转移、分子筛层析等。
12楼2014-07-12 00:48:39
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简牧风爱

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

请问你的一抗是怎么选择的,我觉得这是做WB的关键。内参显出来,说明你的操作过程没问题,为什么不出目的条带,一些条件很需要认真琢磨,看看一抗选择对不对。

你的目的蛋白一个16,一个一百多,转膜效率都不会太高,再有你应该有一个预染MARKER,可以看一下他的转膜情况
13楼2014-07-12 17:42:43
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tuqi

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

我的也是这样,可无奈。几个月前同样的东西还能出来。现在就不行了。看了很多,问了很多,还是没有答案。上样量加到60ug都不行。一抗国外国内都不行。二抗换了还是不行。真心伤不起。
14楼2015-10-22 20:03:32
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