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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 荧光显微镜
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bayu18

新虫 (正式写手)

[求助] 荧光显微镜

我用荧光显微镜拍摄植物荧光照片，发现同一部位在低曝光值（200ms）和高曝光值（1s）时荧光的颜色有点不同，这是什么原因？哪一个才是比较准确的？
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1楼 2013-10-23 10:58:23
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

西瓜

荣誉版主 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
wizardfan: 金币+3, 谢谢分享经验 2013-10-25 08:47:19
bayu18: 金币+2, ★有帮助 2013-10-25 09:38:01
不同样品的荧光强度不一样，所以需要的曝光时间各不相同。合适的曝光时间，以能看清所需要的细节为宜，在此前提下曝光时间越短越好。过长的曝光时间成像容易模糊，并且容易使样品荧光淬灭。
另外，如果同时有多种荧光蛋白，过强的曝光时间可能导致其他颜色的荧光也显现出来。我自己就同时拍过带红色和绿色荧光的样品，本来滤光片用的是绿色荧光的，结果红色荧光蛋白表达太强，看绿色荧光时竟然也同时能看到红色。
楼主的图片我看是亮度的问题，不用纠结颜色，哪个更能清楚显示你要拍的部位，就选哪一个。现在大部分显微镜拍出来的其实都是黑白图像，颜色都是软件根据设置加上去的伪色，并且可以更改的，所以不要在意颜色啦。
楼主先弄清楚自己需要看的地方是哪里，然后再根据上面说的调节曝光时间就可以了。原则其实就一个：看清你需要的细节。
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10楼2013-10-24 21:03:50
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bayu18

新虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by lionllp at 2013-10-23 17:15:58
根据那个技术员说的可以看出，你的第一张图片曝光过度。图片中红色小点有6、7处。在显微镜的曝光设置中调一下。我们的是技术员调好的，就是确定一个点，刚开始出现红色为最佳。（最多一个红点并且很小）。第二张就 ...

那几个红点是其他物质的荧光，是本来就有的
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8楼2013-10-23 19:13:26
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普通回帖

lionllp

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
肯定颜色有不同了，之前我们买了蔡司显微镜，那个培训的技术员说：要高品质的图片，曝光时间就比较长。你可以参考一下！
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2楼2013-10-23 11:10:44
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bayu18

新虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by lionllp at 2013-10-23 11:10:44
肯定颜色有不同了，之前我们买了蔡司显微镜，那个培训的技术员说：要高品质的图片，曝光时间就比较长。你可以参考一下！

颜色不同的原因是什么？谢谢！！
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3楼2013-10-23 13:26:15
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these119

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你是颜色怎么个不同，要是只是亮暗的差别，那很明显是曝光时间导致的。要是明显是两种颜色，有两种原因，第一种是过分曝光，导致颜色变化；第二种是显微镜的滤片设置
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4楼2013-10-23 15:36:58
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lionllp

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
bayu18: 金币+1 2013-10-23 16:20:01
引用回帖:
3楼: Originally posted by bayu18 at 2013-10-23 13:26:15
颜色不同的原因是什么？谢谢！！...

上次听那个技术员说，普通的显微镜是透射光源，而荧光是由一个激发光投射到荧光染料上，荧光再反射回目镜的。曝光时间不同，颜色也应该不同。具体我也解释不清，我也是外行，仅供参考，看看其他虫友的解释。
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5楼2013-10-23 15:39:20
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bayu18

新虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by these119 at 2013-10-23 15:36:58
你是颜色怎么个不同，要是只是亮暗的差别，那很明显是曝光时间导致的。要是明显是两种颜色，有两种原因，第一种是过分曝光，导致颜色变化；第二种是显微镜的滤片设置

这是我的两张同一部位在不同曝光值下的荧光照片（其他都相同，只是曝光值不同），你能解析一下颜色变化是由于哪种原因么？
荧光显微镜
CK20倍-曝光1s.jpg


荧光显微镜-1
CK20倍-曝光200ms.jpg
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6楼2013-10-23 15:43:05
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lionllp

木虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by bayu18 at 2013-10-23 15:43:05
这是我的两张同一部位在不同曝光值下的荧光照片（其他都相同，只是曝光值不同），你能解析一下颜色变化是由于哪种原因么？

CK20倍-曝光1s.jpg

CK20倍-曝光200ms.jpg
...

根据那个技术员说的可以看出，你的第一张图片曝光过度。图片中红色小点有6、7处。在显微镜的曝光设置中调一下。我们的是技术员调好的，就是确定一个点，刚开始出现红色为最佳。（最多一个红点并且很小）。第二张就有点暴光不足。一般显微镜都是设置好的，我们的显微镜软件有自动曝光按钮，用着就比较方便。你可以试着再调调。
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7楼2013-10-23 17:15:58
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daibingling

铁虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
bayu18: 金币+1, ★有帮助 2013-10-25 09:38:21
显然第一张曝光时间太长了，荧光拍照的曝光时间，主要就是背景得保证是黑的。
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9楼2013-10-24 09:43:27
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