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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 切胶纯化蛋白，加loadingbuffer跑sds-page没有条带。
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chen112323

铜虫 (初入文坛)

[求助] 切胶纯化蛋白，加loadingbuffer跑sds-page没有条带。 已有1人参与

6块胶切下来的蛋白条带放在透析袋里，加了10ml 1xTris-Glys，在加了 1xTris-Glys水平电泳仪里跑了2小时，横向跑的，跑透明了，胶上还有些浅浅的条带。放在pbs透析过夜了。之后呈絮状，测浓度将近1mg/ml。纯化后的蛋白加Loading buffer混匀就上样了，没有煮。跑SDS-PAGE没有条带。这是为什么，虚心请教。
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1楼 2013-10-19 20:45:57
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danchai

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
11楼: Originally posted by chen112323 at 2013-10-27 19:48:00
我的后来跑了又，有条带 但是好像降解了， 而且杂带较多。现在又用镍柱纯化了，非常感谢你！...

跑胶的温度太高会引起降解，电泳时可以加冰浴
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12楼2013-10-29 12:01:34
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xiangxiang07

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
chen112323: 金币+3, ★有帮助 2013-10-20 20:58:46
可能纯化出来的蛋白变性沉淀了，没有跑进胶里去，你浓缩胶上样空的那地方染色有蓝色的带么
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7楼2013-10-20 19:37:23
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chen112323

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by xiangxiang07 at 2013-10-20 19:37:23
可能纯化出来的蛋白变性沉淀了，没有跑进胶里去，你浓缩胶上样空的那地方染色有蓝色的带么

感谢回复！没有条带，我没有浓缩的还。我跑水平的时候没有反向跑，透析的时候没有完全排除空气，其他都正常的感觉，不知道为什么？变形沉淀之后怎么转变为可溶？
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8楼2013-10-20 20:58:03
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danchai

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
chen112323: 金币+3, ★有帮助 2013-10-27 19:46:56
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-10-27 22:15:37
首先保证切下来的胶含有目的条带，我是切一竖条染色，对应切的胶，胶回收用的是水平电泳槽，缓冲液50mmTris-HCl+1MMEDTA pH8.0，透析袋中加2-4ml缓冲液，跑胶30min，之后浓缩电泳可以看到条带
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10楼2013-10-21 11:56:12
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