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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 测序问题
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blueghost2

新虫 (小有名气)

[求助] 测序问题

我做的实验是重组载体的构建，双酶切验证都是对的，然后测序测了好多次，每次都是说有重叠现象导致不能测序，我问测序公司什么是重叠现象，他说样本中干扰较大测序失败，真是纠结都测了一个多月了，那位高人指点一下啊！！！！！！急急急！！！！！
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1楼 2013-10-09 10:39:03
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nuoyaeva

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
blueghost2: 金币+3, ★★★很有帮助 2013-10-12 10:02:15
引用回帖:
12楼: Originally posted by blueghost2 at 2013-10-11 10:45:38
恩，我也这么想的，如果这次换的引物还是测不出来，就自己设计引物。我的片段1458，是否可以用我pcr的引物，然后再中间再设计个引物进行测序？高人指点一下...

直接用PCR的引物，那么你引物及其附近范围的序列就没办法确认了，因为测序起始和结束部位都是dirty信号，而且1458用头尾测序比较尴尬，中间的范围可能覆盖不到，一般保守一点估计，一条测序链有效读取范围在600-700bp。
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生活是美好的
14楼2013-10-11 17:41:36
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wuyao0513

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
换个公司测序吧，实在不行就双酶切后测你的酶切片段
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2楼2013-10-09 11:13:53
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nuoyaeva

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2013-10-09 14:16:52
是不是你的目的蛋白有比较接近的isoform啊，我最近在构建一个质粒，双酶切没问题，但是把质粒做模板PCR的时候，隐约看到是两条相近的带重叠在一起。因为序列很接近，没办法分离开，然后测序的时候就经常测不出来，因为我是自己测序，所以我反复多次分节测序，才基本确定获得的目的条带是我需要的…
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生活是美好的
3楼2013-10-09 11:47:12
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blueghost2

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by wuyao0513 at 2013-10-09 11:13:53
换个公司测序吧，实在不行就双酶切后测你的酶切片段

换过一次，说是没信号
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4楼2013-10-09 16:55:49
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