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【转贴】常用蛋白酶活力测定--福林-酚法（包括缓冲液选择）【已搜无重复】
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测定过程中要处理好几个关键点，如酪蛋白溶解要比较好。 采用福林酚法。 1 标准曲线的绘制 （1）酪素溶液的配置 精确称取酪素2.000g，先用少量的0.5mol/l氢氧化钠润湿后，加入少量的相应缓冲液，在沸水浴中加热，经常但不要剧烈的搅拌使完全溶解。冷却后移入100ml容量瓶中，并用相应的缓冲液定容至刻度。酪素溶液可在4℃保存一周，变质时不能使用。 （2）按下表配置不同浓度的酪氨酸 表1 酪氨酸的稀释表 管号 酪氨酸浓度（ug/ml） 酪氨酸溶液体积（ml） 0.2 N Hcl（ml） 1 0 0 10 2 10 1 9 3 20 2 8 4 30 3 7 5 40 4 6 6 50 5 5 7 60 6 4 各取1ml，各加5mlNaCO3溶液，1ml福林试剂，置于40土0.2℃水浴中显色，取出，在680nm处比色，测定吸光度。以吸光度为纵坐标，酪氨酸的浓度为横坐标，绘制标准曲线。 5.2待测酶液的制备 称取酶粉0.1，精确至0.0001，用相应缓冲液溶解，并用玻璃棒捣研，然后将上清液小心倾入容量瓶中，沉淀中再加入少量上述缓冲液。如此溶解、捣研次，最后全部转入容量瓶中，用缓冲液定容至刻度，摇匀。 5.3 比色测定 精确吸取待测酶液1.0ml(每个样品3支平行试管)，40℃水浴预热2min。同时取适量1%酪素溶液在40℃水浴预热3～5min，然后取其1.0ml，加入到经预热的上述酶液中，立即开始计时，于40℃水浴精确反应10min，立即加入2.0ml0.4mol/L三氯乙酸，摇匀，取出静置10min，过滤，取滤液1.0ml。加入0.4mol/L碳酸钠溶液5.0ml，以后按标准曲线绘制步骤测定样品吸光度。 同时进行空白对照测定，其步骤为吸取待测酶液1.0ml，40℃水浴2 min后加入2.0ml 0.4mol/L三氯乙酸，40℃水浴10min，然后加入1%酪素溶液1.0ml ，取出静置10min，过滤，取滤液1.0ml，以后步骤同于样品测定。 6.计算 X=(A×K×4×n)/(1×10) 式中：X－样品的酶活力，u/g； A－样品平行试验的平均吸光度； K－比色常数； 4－反应试剂体积(ml)； n－样品稀释倍数(制备成的酶液ml数/2g酶粉)，ml/g； 1－参与反应的酶液量，ml； 10－反应时间，min。 [ Last edited by shinefeng on 2007-12-16 at 12:52 ] |
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