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关于固相合成法中文文献一篇
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Fmoc固相合成法 刘振南，黄 强 摘 要： 介绍蛋白质固相合成中Fmoc合成法的现状及进展. 关键词： 肽；固相合成；耦联反应 分类号： O621.3 文献标识码： A Fmoc Solid Phase Synthesis LIU Zhen-nan1,HUANG Qiang2 (1.Dept.of Chemistry and Chemical Engineering ,Guangxi University for Nationalities，Guangxi Naning 530006，China；2.Nurse School, Guangxi Medical University, Guangxi Nanning 530023，CHina) Abstract: This paper introduces the current situation and development of Fmoc synthesis in protein solid phase synthesis. Key Words: Peptide;Solid phase synthesis;Coupled reaction 0 引言 1963年，R.B.Merrifield［1］创立了将氨基酸的C末端固定在不溶性树脂上，然后在此树脂上依次缩合氨基酸，延长肽链、合成蛋白质的固相合成法.在固相法中，每步反应后只需简单地洗涤树脂，便可达到纯化目的.克服了经典液相合成法中的每一步产物都需纯化的困难，为自动化合成肽奠定了基础.为此，Merrifield获得1984年诺贝尔化学奖. 今天，固相法得到了很大发展.除了Merrifield所建立的Boc法(Boc:叔丁氧羰基)之外，又发展了Fmoc固相法(Fmoc:9-芴甲氧羰基).以这两种方法为基础的各种肽自动合成仪也相继出现和发展，并仍在不断得到改造和完善. Merrifield所建立的Boc合成法［2］是采用TFA(三氟乙酸)可脱除的Boc为α-氨基保护基，侧链保护采用苄醇类.合成时将一个Boc－氨基酸衍生物共价交联到树脂上，用TFA脱除Boc，用三乙胺中和游离的氨基末端，然后通过DCC活化、耦联下一个氨基酸，最终脱保护多采用HF法或TFMSA(三氟甲磺酸)法.用Boc法已成功地合成了许多生物大分子，如活性酶、生长因子、人工蛋白等. 在Boc合成法中，反复地用酸来脱保护，这种处理带来了一些问题：如在肽与树脂的接头处，当每次用50%TFA脱Boc基时，有约1.4%的肽从树脂上脱落，合成的肽越大，这样的丢失越严重；此外，酸催化会引起侧链的一些副反应.Boc合成法尤其不适于合成含有色氨酸等对酸不稳定的肽类.1978年，Chang、Meienlofer和Atherton等人采用Carpino［3］报道的Fmoc(9-芴甲氧羰基)基团作为α-氨基保护基，成功地进行了多肽的Fmoc固相合成.Fmoc法与Boc法的根本区别在于采用了碱可脱除的Fmoc为α-氨基的保护基.侧链的保护采用TFA可脱除的叔丁氧基等，树脂采用90%TFA可切除的对烷氧苄醇型树脂和1%TFA可切除的二烷氧苄醇型树脂，最终的脱保护避免了强酸处理. 1 Fmoc固相肽合成法的基本原理［4］［2］ 如图所示，首先将一个用Fmoc基团对α-氨基进行保护的氨基酸通过一个支臂连结到一个不溶性载体上，随后将α-氨基脱保护，用溶液洗涤氨基酸―支臂―树脂. 将第二个预先活化的α-氨基保护的氨基酸通过耦联反应连接上去.此外，也可以用α-N端及侧链保护的肽片断代替单个的氨基酸进行耦联反应，缩合反应完成后，用溶液洗涤，重复进行脱保护、耦联，直到得到目的肽.最后将肽―支臂―树脂裂解.这种延长肽链的固相合成法既可采用间断的方法，也可使用连续流动的方法. (1) C末端氨基酸与树脂结合 (2) Na-Fmoc的脱除、洗涤 (3) 耦联、洗涤 (4) 重复(2)～(3)步 (5) 脱保护基 图1 Fmoc固相法示意图 2 Fmoc合成法中的固相载体 聚苯乙烯树脂，通过间二乙烯基苯交联而成，是固相合成中最早、早常用的载体，从溶胀性和稳定性考虑，1%的交联度最适宜.另一类常用载体为聚丙烯酰胺凝胶，由于在结构和极性上与肽链相似，被认为更利于多肽合成.在连续流动法中，树脂与肽一直处于溶剂化状态，这需要载体能承受溶剂连续流动造成的一定压力，珠状凝胶不能达到这一要求.解决方法是将珠状凝胶与低密度高渗透性的无机载体相连.一种名为Kieselguhr的无机载体与聚丙烯酰胺凝胶相连已成功地用于连续流动的Fmoc固相合成. 3 Fmoc合成法中的树脂接臂 考虑到与树脂相连的肽C末端氨基酸的不同类型，如羧酸型、酰胺型等，常常需要在树脂上连接不同支臂以供交联. 在合成C末端为羧酸的肽时，常采用对烷氧苄醇或对羟甲酚苄醇为支臂，最后用50%～100%的TFA裂解得到游离酸.4―羟基苯氧乙酸支臂对酸稳定，需要用HF或TFMSA才能断裂.当合成的肽侧链带有保护基时，应采用在更弱条件下裂解的支臂如3―(4′―羟甲基苯基)－3―三甲硅丙酸，用四丁基氟化铵处理5分钟即可得到肽酸.合成肽酰胺时，在稀TFA作用下得到产物.此外，当用TFA处理3―(对苄氧苯)－1，1―二甲基丙氧羰酰肼树脂时，产物为肽酰肼. 4 Fmoc―氨基酸的制备和侧链保护 Fmoc基团是在有NaHCO3或Na2CO3存在的二氧六环溶液中，通过以下反应引入到氨基酸中的： 理想的Fmoc-氨基酸的侧链保护基应在碱性条件下稳定，在酸性条件下脱除.下面对其做一介绍. 4.1 Asp和Glu Asp和Glu侧链羧基常用t-Bu保护.可用TFA、TMSBr等脱除.但是用t-Bu保护仍有侧链环化形成酰亚胺的副反应发生.近年来，发展了一些新的保护基如环烷醇酯、金刚烷醇酯等可减轻这一副反应，这些保护基可用TMSOTf(三氟甲磺酸三甲硅烷酯)除去. 4.2 Ser、Thr和Tyr ser、Thr的羟基及Tyr的酚羟基通常用t-Bu保护.叔丁基的引入比较麻烦，首先ser制成苄氧羰基酯，再在酸催化下与异丁烯反应.Ser和Thr还可用苄基保护，Ser用苄醇引入苄基、Thr用溴苄引入苄基. 4.3 Asn和Gln Asn和Gln侧链的酰胺键在肽合成中一般不加以保护.但合成大肽时，Asn和Gln的α-羧基活化时可能会发生分子内脱氢反应生成氰基化合物.碱性时Gln的侧链可以环化生成酰胺.而且不保护的Fmoc-Gln和Fmoc-Asn在DCM中溶解度很差.为了避免这些问题，可以用9-咕吨基，2，4，6-三甲氧苄基，4，4′―二甲氧二苯甲基或三苯甲基等保护，这四种基因均可用TFA脱除. 4.4 His His是最容易发生消旋化的氨基酸，必须加以保护. 对咪唑环的非π-N开始用苄基(Bzl)和甲基磺酰基(TOS)保护.但这两种保护基均不太理想.TOS对亲核试剂不稳定，Bzl需要用氢解或Na/NHs除去，并且产生很大程度消旋.Boc基团是一个较理想的保护基，降低了咪唑环的碱性，抑制了消旋，成功地进行了一些合成.但是当反复地用碱处理时，也表现出一定的不稳定性.哌啶羰基在碱中稳定，但是没能很好地抑制消旋，而且脱保护时要用很强的亲核试刘如 . 对咪唑环π-N保护，可以完全抑制消旋，π-N可以用苄氧甲基(Bom)和叔丁氧甲基(Bum)保护，(Bum)可以用TFA脱除，Bom更稳定些，需用催化氢解或强酸脱保护，Bum是目前很有发展前途的His侧链保护基，其不足之处在于Fmoc(His)Bum在DCM和DMF中的溶解度较差. 4.5 Cys Cys的－SH具有强亲核性，易被酰化成硫醚，也易被氧化为二硫键，必须加以保护.常用保护基有三类：一类用TFA可脱除，如对甲苄基、对甲氧苄基和三苯甲基等；第二类可用(CF3CO)3T1／TFA脱除，对TFA稳定.如t-Bu、Bom和乙酰胺甲基等.第三类对弱酸稳定，如苄基和叔丁硫基(stBu)等，Cys(StBu)可用巯基试剂和磷试剂还原，Cys(Bzl)可用Na/NH3(1)脱保护. 4.6 Arg Arg的胍基具有强亲核性和碱性，必须加以保护.理想的情况是三个氮都加以保护，实际上保护1或2个胍基氮原子.保护基分四类：(1)硝基(2)烷氧羰基(3)磺酰基(4)三苯甲基. 硝基在制备、酰化裂解中产生很多副反应，应用不广.烷氧羰基应主要有Boc和二金刚烷氧羰基(Adoc)2、Fmoc(Arg)Boc的耦联反效率不高，哌啶理时不处稳定，会发生副反应；Adoc保护了两个非π－N，但有同样的副反应发生.对磺酰基保护，其中TOS应用最广，但它较难脱除.近年来2，3，6-三甲基-4-甲氧苯横酰基(Mtr)较受欢迎，在TFA/ 作用下，30分钟即可脱除，但是它们都不能完全抑制侧链的酰化发生.三苯甲基保护基可用TFA脱除.缺点是反应较慢，侧链仍有酰化反应，且其在DCM、DMF中溶解度不好. 4.7 Lys Lys的ε-NH2必须加以保护.但与α－NH2的保护方式应不同，该保护基要到肽链合成后除去.ε－NH2的保护无消旋问题，可以采用酰基保护基，如 ，其它常用的保护基有苄氧碳基和Boc. 5 Fmoc基团的脱除 Fmoc基团的芴环系的吸电子作用使9-H具有酸性，易被较弱碱除去，反应条件很温和.反应过程可表示如下： 哌啶进攻9-H,β消除形成二苯芴烯，很容易被二级环胺进攻形成稳定的加成物.Fmoc基团对不同的碱稳定性不同，可根据实际条件选用. 6 耦联反应 固相中的接肽反应原理与液相中基本一致.将两个相应的氨基被保护的及羧基被保护的氨基酸放在溶液内，并不形成肽键.要形成酰胺键，经常用的手段是将羧基活化，其方法是将它变成混合酸酐，或者将它变为活泼酯、酰氯，或者用强的失去剂(碳二亚胺)也可形成酰胺键，耦联反应可表示如下：(A：羰基活泼试剂) 碳二亚胺是常用的活化试剂，其中DCC使用范围最广，其缺点是形成了不溶于DCM的DCH，过滤时又难于除尽.其他一些如二异丙基碳二亚胺(DIC)、甲基叔丁基碳二亚胺也用于固相合成中，它们形成的脲溶于DCM中，经洗涤可以除去.其他活化试剂还有Bop( Bop－C1、氯甲酸异丙酯、氯甲酸异丁酯、SOC12等.其中DCC、Bop活化形成对称酸酐、SOC12形成酰氯，其余三种形成不对称酸酐. 6.1 对称酸酐法 用DCC形成对称酸酐的方法使用较广.其缺点是有些氨基酸在DCM中不易溶解，生成的Fmoc氨基酸酐溶解度更差.同时还有些副反应，如形成二肽、消旋等. 6.2 混合酸酐法 最常用试剂是氯甲酸的异丙基酯和异丁基酯.前者得到的酸酐稳定性好.只产生很少消旋，在适当的化学计量及溶剂条件下，耦联反应很快.而且，在此反应中使用的N-甲基吗啉和N-甲基哌啶对Fmoc基团无影响. 6.3 酰氯法 在Boc法中不常用的酰氯，因为比较激烈，一些保护基如Boc不稳定.但是，Fmoc基团可以耐受酰氯处理，生成的Fmoc氨基酰氯也很稳定.在三甲基乙酸／三胺或苯并三氮唑／二异丙基乙二胺中，反应速度很快，消旋很少.酰氯法在固相合成中应用还不多，但已表明，Fmoc－氨基酰氯适用于合成有立体障碍的肽序列. 6.4 活化酯法 活化酯法在固相合成中应用最为广泛.采用过的试剂也很多，近来最常用的有HOBt酯、ODhbt酯、OTDO酯等. HOBt酯反应快，消旋少，用碳二亚胺很容易制得；ODhbt酯很稳定，容易进行分离纯化，与HOBt酯具有类似的反应性和消旋性能，它还有一个优越之处，在酰化时有亮黄色、耦联结束时颜色消失，有利于监测反应；OTDO酯与ODhbt酯类似，消旋化极低，易分离，酰化时伴有颜色从桔红色到黄色的变化等. 6.5 原位法 将碳二亚胺和α－N保护氨基酸直接加到树脂中进行反应叫做原位法. 用DIC代替DCC效果更好.其他的活化试剂还有Bop和Bop-C1等.原位法反应快、副反应少、易操作.其中DIC最有效，其次是Bop、Bop-C1等.遗憾的是Bop酰化时生成致癌的六甲基磷酰胺，限制了其应用. 7 裂解及侧链保护基脱除 Fmoc法裂解和脱侧链保护基时可采用弱酸.TFA为应用最广泛的弱酸试剂，它可以脱除t-Bu、Boc、Adoc、Mtr等；条件温和、副反应较少.不足之处：Arg侧链的Mtr很难脱除，TFA用量较大；无法除掉Cys的t-Bu等基因.也有采用强酸脱保护的方法：如用TFMSA和HF来脱除一些对弱酸稳定的保护基，如His的Bom，Asp、Glu、Ser、Thr的Bzl(苄基)保护基等，但是当脱除Asp 的吸电子保护基时，会引起环化副反应.而TMSBr和TMSOTf在有苯甲硫醚存在时，脱保护速度很快.此外，根据条件不同，碱、光解、氟离子和氢解等脱保护方法也有应用. 8 结束语 Fmoc基团用于固相合成多肽已经有了十多年的历史，在合成一些含有在酸性条件下不稳定的氨基的残基的肽时，具有特别优越之处.将Fmoc法和Boc法互相补充，定会在合成更多、更大的生物分子中发挥更大作用. 作者单位：刘振南(广西民族学院 化学化工系，广西 南宁 530006） 黄 强（广西医科大学 附设护士学校，广西 南宁 530021) 参 考 文 献 ［1］陶慰孙，李惟，姜涌明等.蛋白质分子基础(第三版)［M］.北京：高等教育出版社，1995.133～147. ［2］Louis A.Carpino, Grace Y.Han, J Am.chem Soc.1970,92:5748～5749. ［3］Gregg B,Fields Richard L, Noble.Peptide protein Res Int J, 1990,35:161～214. |
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