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anni8953

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by DBWJ at 2013-09-05 09:53:23
我跑胶的时候基本上是习惯吧浓缩胶弄掉，你这个是考染吗？胶有点脏的说。
5%浓缩12%分离一般是没问题的，蛋白为什么在中间的看你蛋白的大小啊，没有小分子量的蛋白的话下面没蛋白也正常啊。你这个是什么蛋白啊？去 ...

我这个是考染
胶脏我也愁呢 是考马斯亮蓝的问题吗？还是什么其他的原因？
小麦的蛋白
怎么能看出来杂质较多呢？
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11楼2013-09-05 21:41:01
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anni8953

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
10楼: Originally posted by tujuo at 2013-09-05 14:48:28
其实单独跑电泳的话上样不用太多，上太多了带与带之间的分界就容易模糊，尤其是蛋白条带密集的区域。我一般上样5ul就能跑的很清楚（我的样品蛋白浓度高有5-10ug/ul）而且，蛋白酶抑制剂和去除核酸这两步非常重要（好 ...

蛋白酶抑制剂 用的是1mMPMSF
去除核酸用的是80%丙酮清洗30min 两次 丙酮清洗30min 最后离心晾干
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12楼2013-09-05 21:44:45
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wangchclove

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
wizardfan: 金币+1, 谢谢参与 2013-09-07 06:25:56
这个marker也有些模，可能是胶跑热了，放冷凝水或者放在层析柜里面跑，也有可能是胶浓度过高导致，试着降低分离胶浓度。
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Good
13楼2013-09-06 10:51:30
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

我认为楼主的SDS-PAGE电泳带比较弥散，建议改进措施:
1.可以适当进一步地拉开浓缩胶和分离胶之间的pH值，比如浓缩胶为pH=6.6，分离胶为pH=8.9。
2.可以考虑加高电泳时，浓缩胶的电压为90-100 V，分离胶的电压到120V-200V，；浓缩胶和分离胶有时候可能都设成150 V也能电泳成功。
3.使用全新配置的缓冲溶液。
4.适当该种胶浓度下使用分离效果明显的Marker。
5.保持各种蛋白质样品和Marker在上样前能够充分溶解，上样前最好离心一下，实在溶解不掉的颗粒就去掉。
6.适当调整聚丙烯酰胺的凝胶浓度。
7. 聚丙烯酰胺的充分聚合，可提高凝胶的分辨率。建议做法：待凝胶在室温凝固后，可在室温下放置一段时间使用。忌即配即用或4度冰箱放置，前者易导致凝固不充分，后者可导致SDS结晶。一般凝胶可在室温下保存4天，SDS可水解聚丙烯酰胺。8.样品缓冲溶液用：Tris-HCl缓冲溶液，电泳缓冲溶液用:Tris–Gly缓冲溶液。9.分离胶的浓度应高于浓缩胶，但是胶浓度高会引起电泳时间变长，电泳时间会引起电泳带弥散。具体的参考的凝胶浓度参见附录。
10.控制好电泳时间，别把样品跑出了胶外。

附录：1.样品处理（充分溶解样品）：根据样品分离目的不同，在上样前对样品进行的溶解处理主要有三种处理方法：还原SDS处理、非还原SDS处理、带有烷基化作用的还原SDS处理。（1）还原SDS处理：在上样buffer中加入SDS和DTT(或Beta巯基乙醇)后，蛋白质构象被解离，电荷被中和，形成SDS与蛋白相结合的分子，在电泳中，只根据分子量来分离。一般电泳均按这种方式处理，样品稀释适当浓度，加入上样Buffer，离心，沸水煮5min，再离心加样。（2）带有烷基化作用的还原SDS处理：碘乙酸胺的烷基化作用可以很好的并经久牢固的保护SH基团，得到较窄的谱带;另碘乙酸胺可捕集过量的DTT，而防止银染时的纹理现象。100μl样品缓冲液中10μl 20%的碘乙酸胺，并在室温保温30min。（3）非还原SDS处理：生理体液、血清、尿素等样品，一般只用1%SDS沸水中煮3min，未加还原剂，因而蛋白折叠未被破坏，不可作为测定分子量来使用。
2.在SDS-PAGE不连续电泳中，pH对整个反应体系的影响是至关重要的。制胶缓冲液使用的是Tris-HCL缓冲系统，浓缩胶是pH6.8，分离胶pH8.8;而电泳缓冲液使用的Tris-甘氨酸缓冲系统。在浓缩胶中，其pH环境呈弱酸性，因此甘氨酸解离很少，其在电场的作用下，泳动效率低;而Cl离子却很高，两者之间形成导电性较低的区带，蛋白分子就介于二者之间泳动。由于导电性与电场强度成反比，这一区带便形成了较高的电压剃度，压着蛋白质分子聚集到一起，浓缩为一狭窄的区带。当样品进入分离胶后，由于胶中pH(>8.8)的增加，呈碱性，甘氨酸大量解离，泳动速率增加，直接紧随氯离子之后，同时由于分离胶孔径的缩小，在电场的作用下，蛋白分子根据其固有的带电性和分子大小进行分离。所以，pH对整个反应体系的影响是至关重要的，实验中在排除其他因素之后仍不能很好解决问题的情况，应首要考虑该因素，即适当进一步地拉开浓缩胶和分离胶之间的pH值的差值。
3. 聚丙烯酰胺凝胶浓度与蛋白质分离范围的关系：聚丙烯酰胺凝胶浓度/% 蛋白质分离范围/kd5                  
36—2007.5                    24—20010                      14—20012.5                    14—10015                     14—60浓缩胶浓度低；分离胶浓度高于浓缩胶，一般不小于5%。
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14楼2013-09-08 17:12:12
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

更正：
聚丙烯酰胺凝胶浓度/%            蛋白质分离范围/kd
5%                                                36—200
7.5 %                                             24—200
10 %                                                14—200
12.5  %                                           14—100
15 %                                                14—60
浓缩胶浓度低；分离胶浓度高于浓缩胶，一般不小于5%。2KD的蛋白质必须要用Tricine胶系统，上面说的改进对于分子量低于3KD的蛋白质的电泳没有用，但是对于高于3KD的蛋白质的电泳有用。
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15楼2013-09-08 17:32:01
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