应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

Znn3bq.jpeg
小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » SDS跑蛋白新手求助
152/2返回列表上一页12
查看: 2258  |  回复: 14
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

anni8953

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by DBWJ at 2013-09-05 09:53:23
我跑胶的时候基本上是习惯吧浓缩胶弄掉，你这个是考染吗？胶有点脏的说。
5%浓缩12%分离一般是没问题的，蛋白为什么在中间的看你蛋白的大小啊，没有小分子量的蛋白的话下面没蛋白也正常啊。你这个是什么蛋白啊？去 ...

我这个是考染
胶脏我也愁呢 是考马斯亮蓝的问题吗？还是什么其他的原因？
小麦的蛋白
怎么能看出来杂质较多呢？
赞一下 回复此楼
11楼2013-09-05 21:41:01
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

anni8953

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
10楼: Originally posted by tujuo at 2013-09-05 14:48:28
其实单独跑电泳的话上样不用太多，上太多了带与带之间的分界就容易模糊，尤其是蛋白条带密集的区域。我一般上样5ul就能跑的很清楚（我的样品蛋白浓度高有5-10ug/ul）而且，蛋白酶抑制剂和去除核酸这两步非常重要（好 ...

蛋白酶抑制剂 用的是1mMPMSF
去除核酸用的是80%丙酮清洗30min 两次 丙酮清洗30min 最后离心晾干
赞一下 回复此楼
12楼2013-09-05 21:44:45
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

wangchclove

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
wizardfan: 金币+1, 谢谢参与 2013-09-07 06:25:56
这个marker也有些模，可能是胶跑热了，放冷凝水或者放在层析柜里面跑，也有可能是胶浓度过高导致，试着降低分离胶浓度。
赞一下 回复此楼
Good
13楼2013-09-06 10:51:30
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

我认为楼主的SDS-PAGE电泳带比较弥散，建议改进措施:
1.可以适当进一步地拉开浓缩胶和分离胶之间的pH值，比如浓缩胶为pH=6.6，分离胶为pH=8.9。
2.可以考虑加高电泳时，浓缩胶的电压为90-100 V，分离胶的电压到120V-200V，；浓缩胶和分离胶有时候可能都设成150 V也能电泳成功。
3.使用全新配置的缓冲溶液。
4.适当该种胶浓度下使用分离效果明显的Marker。
5.保持各种蛋白质样品和Marker在上样前能够充分溶解，上样前最好离心一下，实在溶解不掉的颗粒就去掉。
6.适当调整聚丙烯酰胺的凝胶浓度。
7. 聚丙烯酰胺的充分聚合，可提高凝胶的分辨率。建议做法：待凝胶在室温凝固后，可在室温下放置一段时间使用。忌即配即用或4度冰箱放置，前者易导致凝固不充分，后者可导致SDS结晶。一般凝胶可在室温下保存4天，SDS可水解聚丙烯酰胺。8.样品缓冲溶液用：Tris-HCl缓冲溶液，电泳缓冲溶液用:Tris–Gly缓冲溶液。9.分离胶的浓度应高于浓缩胶，但是胶浓度高会引起电泳时间变长，电泳时间会引起电泳带弥散。具体的参考的凝胶浓度参见附录。
10.控制好电泳时间，别把样品跑出了胶外。

附录：1.样品处理（充分溶解样品）：根据样品分离目的不同，在上样前对样品进行的溶解处理主要有三种处理方法：还原SDS处理、非还原SDS处理、带有烷基化作用的还原SDS处理。（1）还原SDS处理：在上样buffer中加入SDS和DTT(或Beta巯基乙醇)后，蛋白质构象被解离，电荷被中和，形成SDS与蛋白相结合的分子，在电泳中，只根据分子量来分离。一般电泳均按这种方式处理，样品稀释适当浓度，加入上样Buffer，离心，沸水煮5min，再离心加样。（2）带有烷基化作用的还原SDS处理：碘乙酸胺的烷基化作用可以很好的并经久牢固的保护SH基团，得到较窄的谱带;另碘乙酸胺可捕集过量的DTT，而防止银染时的纹理现象。100μl样品缓冲液中10μl 20%的碘乙酸胺，并在室温保温30min。（3）非还原SDS处理：生理体液、血清、尿素等样品，一般只用1%SDS沸水中煮3min，未加还原剂，因而蛋白折叠未被破坏，不可作为测定分子量来使用。
2.在SDS-PAGE不连续电泳中，pH对整个反应体系的影响是至关重要的。制胶缓冲液使用的是Tris-HCL缓冲系统，浓缩胶是pH6.8，分离胶pH8.8;而电泳缓冲液使用的Tris-甘氨酸缓冲系统。在浓缩胶中，其pH环境呈弱酸性，因此甘氨酸解离很少，其在电场的作用下，泳动效率低;而Cl离子却很高，两者之间形成导电性较低的区带，蛋白分子就介于二者之间泳动。由于导电性与电场强度成反比，这一区带便形成了较高的电压剃度，压着蛋白质分子聚集到一起，浓缩为一狭窄的区带。当样品进入分离胶后，由于胶中pH(>8.8)的增加，呈碱性，甘氨酸大量解离，泳动速率增加，直接紧随氯离子之后，同时由于分离胶孔径的缩小，在电场的作用下，蛋白分子根据其固有的带电性和分子大小进行分离。所以，pH对整个反应体系的影响是至关重要的，实验中在排除其他因素之后仍不能很好解决问题的情况，应首要考虑该因素，即适当进一步地拉开浓缩胶和分离胶之间的pH值的差值。
3. 聚丙烯酰胺凝胶浓度与蛋白质分离范围的关系：聚丙烯酰胺凝胶浓度/% 蛋白质分离范围/kd5                  
36—2007.5                    24—20010                      14—20012.5                    14—10015                     14—60浓缩胶浓度低；分离胶浓度高于浓缩胶，一般不小于5%。
赞一下 回复此楼
14楼2013-09-08 17:12:12
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

更正：
聚丙烯酰胺凝胶浓度/%            蛋白质分离范围/kd
5%                                                36—200
7.5 %                                             24—200
10 %                                                14—200
12.5  %                                           14—100
15 %                                                14—60
浓缩胶浓度低；分离胶浓度高于浓缩胶，一般不小于5%。2KD的蛋白质必须要用Tricine胶系统，上面说的改进对于分子量低于3KD的蛋白质的电泳没有用，但是对于高于3KD的蛋白质的电泳有用。
赞一下 回复此楼
15楼2013-09-08 17:32:01
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 anni8953 的主题更新
152/2返回列表上一页12
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 化学工程调剂289 +32 yang婷 2026-04-07 33/1650 2026-04-09 10:18 by wp06
[考研] 求调剂 +3 猪肉墩粉条cc 2026-04-08 4/200 2026-04-09 10:05 by 猪肉墩粉条cc
[考研] 求调剂｜086000生物与医药调剂 +6 awwwwwooooo 2026-04-09 6/300 2026-04-09 09:54 by 壹往無前
[考研] 085404 293求调剂 +4 勇远库爱314 2026-04-08 4/200 2026-04-09 08:56 by 保奔超爱学习
[考研] 化学308分求调剂 +21 你好明天你好 2026-04-07 23/1150 2026-04-08 22:32 by 凯凯要变帅
[考研] 285求调剂 +20 哦呦呼o 2026-04-04 20/1000 2026-04-08 22:23 by yutian743
[考研] 一志愿211，化学学硕，310分，本科重点双非，求调剂 +10 努力奋斗112 2026-04-07 10/500 2026-04-08 15:01 by screening
[考研] 274求调剂求调剂 +10 Jachenbingoo 2026-04-06 13/650 2026-04-08 14:25 by zhq0425
[考研] 一志愿电子科技大学085600材料与化工 329分求调剂 +11 Naiko 2026-04-04 11/550 2026-04-08 14:00 by wutongshun
[考研] 338求调剂 +8 wxygxsaaaaa 2026-04-06 8/400 2026-04-08 06:58 by 无际的草原
[考研] 363求调剂 +9 zh096 2026-04-04 9/450 2026-04-07 21:51 by 418490947
[考研] 材料工程302分求调剂 +13 zyx上岸！ 2026-04-04 13/650 2026-04-07 11:14 by 诗与自由
[考研] 287分求调剂 有专利国奖一志愿哈工大085406 +6 白易辰 2026-04-06 7/350 2026-04-06 22:46 by 875465
[考研] 272求调剂 +4 电气李 2026-04-05 4/200 2026-04-05 10:41 by lbsjt
[考研] 一志愿北交大材料工程总分358 +6 cs0106 2026-04-03 6/300 2026-04-04 11:20 by w_xuqing
[考研] 268求调剂 +8 你好tg 2026-04-03 9/450 2026-04-04 05:08 by gswylq
[考研] 工科341分调剂 +3 洛多罗 2026-04-03 3/150 2026-04-03 14:20 by 1753564080
[考研] 求调剂 +3 usbdndj 2026-04-03 3/150 2026-04-03 14:10 by dxiaoxin
[考研] 266分，一志愿电气工程，本科材料，求材料专业调剂 +9 哇呼哼呼哼 2026-04-02 9/450 2026-04-03 12:05 by 1753564080
[考研] 一志愿大工学硕，求调剂 +4 yub0811 2026-04-02 4/200 2026-04-02 21:36 by 百灵童888
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭